孫銀玲，賀曉波，李永臻，孫海峰

諾卡菌屬菌株04-5195發(fā)酵產(chǎn)物5195B的分離鑒定及其體外抗骨質(zhì)疏松活性研究

孫銀玲*，賀曉波*，李永臻，孫海峰

近年來研究證實，增強成骨細胞作用、改善骨質(zhì)形成代謝、促進骨質(zhì)形成是治療骨質(zhì)疏松新的更為重要的途徑。成骨細胞的增殖和分化受多種因素調(diào)節(jié)，其中骨形態(tài)形成蛋白家族尤其是骨形態(tài)形成蛋白 II（BMP2）在成骨細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，其作為骨形成誘導因子有望成為骨質(zhì)疏松治療的新靶點。

本課題組在前期工作中，成功構(gòu)建了以bmp2啟動子為靶點、含有螢火蟲熒光素酶報告基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型。將在熒光素酶報告基因上游克隆有bmp2基因上游調(diào)控序列的重組質(zhì)粒 pGL4-bmp2轉(zhuǎn)染至小鼠顱骨細胞MC3T3-E1，經(jīng) G418 篩選得到單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株bmp2-Luc MC3T3，利用已知的活性化合物驗證和優(yōu)化該bmp2上調(diào)劑篩選模型，證明其良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性均符合高通量篩選模型的要求。應用該模型對微生物產(chǎn)物餾分庫進行篩選，得到能產(chǎn)生高活性物質(zhì)的菌株04-5195。通過對 04-5195 的形態(tài)特征鑒別、生理生化指標判別、DNA 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果證明其為諾卡菌屬的新種菌株[1]。對 04-5195 菌株發(fā)酵產(chǎn)物通過正相層析分離得到了化合物 5195A，經(jīng)鑒定為 Amicoumacin B[2]，但其并非主要活性組分。本工作采用新的分離工藝流程對菌株發(fā)酵產(chǎn)物重新分離，得到 5195B，經(jīng)鑒定為大豆素（daidzein），體外研究證明其具有上調(diào) BMP2 表達和促成骨細胞分化的作用。

*同為第一作者

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 諾卡菌屬新種菌株 04-5195 由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 細胞株 人骨肉瘤細胞株 MG63 購自中國醫(yī)學科學院細胞中心；SV40 大 T 抗原轉(zhuǎn)染人成骨細胞 hFOB1.19購自美國標準生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.3 試劑盒 熒光素酶檢測試劑盒購自美國 Promega公司；Real-time PCR 試劑盒購自瑞士 Roche 公司；堿性磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 主要實驗儀器 Agilent 1200 LC 型高效液相色譜儀購自美國 Agilent 公司；AKTAexplorer 快速蛋白液相色譜（FPLC）購自美國 GE Health 公司；Envision 熒光讀板儀購自美國 PE 公司；Rotor Gene 3000 型實時定量 PCR儀購自澳大利亞 Corbett Research 公司；Epics XL 型流式細胞儀購自美國 Beckman Coulter 公司；UV-2401 型紫外分光光度計購自日本 Shimadzu 公司；LTQ Orbitrap 型質(zhì)譜分析儀購自美國 Thermo 公司； VNS 600 型核磁共振分析儀購自美國 Verian 公司。

1.2 方法

1.2.1 5195B 的分離純化 04-5195 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)抽濾，將濾液和菌絲體分離。濾液過 HP20 大孔樹脂柱后，分別用3 倍柱體積的水、30% 和 50% 丙酮洗脫，收集 50% 丙酮洗脫液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，真空干燥得到干品 A。04-5195 發(fā)酵菌絲體使用 50% 丙酮充分浸泡，抽濾，除去溶劑后得到干品 B。干品 A 使用 30% 甲醇重新溶解，過ODS 反相柱，在 FPLC 上分別用 3 倍柱體積的 30% 和50% 甲醇洗脫，紫外 248 nm 檢測，對 50% 甲醇洗脫組分按峰收集，收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇并真空凍干后，使用反相制備 HPLC 進一步純化（色譜柱：Agilent 9.4 mm ×250 mm；流動相：50% 乙醇；流速：2 ml/min；保留時間：9.4 min），得到活性單體化合物 5195B。干品 B 按與干品 A相同條件分離得到活性單體化合物 5195C，經(jīng)鑒定與5195B 結(jié)構(gòu)相同。

1.2.2 5195B 的結(jié)構(gòu)鑒定 對 5195B 進行了紫外光譜分析、質(zhì)譜分析、核磁共振氫譜、碳譜分析（DEPT、HSQC、COSY、HMQC），通過文獻查閱進行比對以確定化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.3 BMP2 表達上調(diào)活性研究

1.2.3.1 利用 BMP2 表達上調(diào)劑模型評價藥物活性 消化對數(shù)生長期的模型細胞bmp2-Luc MC3T3，按每孔 5 ×104個接種至白壁透明底 96 孔板中。待細胞充分貼壁后，吸棄含血清培養(yǎng)基，用 PBS 輕輕漂洗細胞 1 次，每孔加入不含血清 MEM 培養(yǎng)基 198 μl 和 2 μl 待測樣品，以終濃度 1 μg/ml 的染料木素為陽性對照，以與待測樣品相同濃度的 DMSO 為空白對照。作用 24 h 后移去培養(yǎng)基，使用熒光讀板儀測定熒光素酶活性。按如下公式計算待測樣品對熒光素酶活性的相對上調(diào)率：相對上調(diào)率（%）＝（S －B）/（P － B）× 100%（S 為待測樣品組細胞熒光素酶活性；B 為空白對照組細胞熒光素酶活性；P 為陽性對照組細胞熒光素酶活性）。

1.2.3.2 Real-time PCR 法考察藥物對 MG63 細胞bmp2mRNA 水平的影響 以不同濃度 5195B（1、5 和 10 μmol/L）處理 MG63 細胞 24 h，TRIzol 法提取細胞總RNA。引物設(shè)計：上游：5′ CGGACTGCGGTCTCCTAA 3′；下游：5′ GGAAGCAGCAACGCTAGAAG 3′。采用 2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.3 流式細胞法考察藥物對 MG63 細胞 BMP2 蛋白表達的影響 以不同濃度 5195B（1、5 和 10 μmol/L）處理 MG63 細胞 24 h，4% 多聚甲醛固定細胞，一抗為山羊抗人 BMP2 單抗，二抗為 FITC 標記兔抗山羊 IgG，每個樣本計數(shù) 5000 ～ 10 000 個細胞。

1.2.4 體外試驗考察藥物促成骨細胞分化作用

1.2.4.1 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 以不同濃度 5195B（5、10、20 和 50 μmol/L）處理 hFOB 細胞（SV40 大 T抗原轉(zhuǎn)染人成骨細胞）72 h，收集細胞培養(yǎng)液，以 ALP 檢測試劑盒測定細胞分泌的 ALP 活性，以樣本在 520 nm 處的吸光度判斷 ALP 活性高低。

1.2.4.2 鈣化結(jié)節(jié)形成檢測 以不同濃度 5195B（5、10、20 和 50 μmol/L）處理 hFOB 細胞，培養(yǎng) 4 周后，von Kossa 染色顯示鈣化結(jié)節(jié)，每個樣本隨機選取 10 個視野。

2 結(jié)果

2.1 5195B 的結(jié)構(gòu)鑒定

5195B 為白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、DMSO 等溶劑。UV λmaxMeOH為 248、302 nm。ESI-MS 給出 [M+1]+為255，則其分子量為 254。5195B 核磁共振分析數(shù)據(jù)如表 1所示，經(jīng)查詢，與大豆素一致，證明 5195B 為大豆素，結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

2.2 5195B 在 BMP2 表達上調(diào)劑模型上的量效關(guān)系

5195B 從 40 μmol/L 向下倍比稀釋，以染料木素為陽

注：于 600 MHz 測定氫譜；150 MHz 測定碳譜。

圖 2 5195B 在 BMP2 表達上調(diào)劑模型上的量效關(guān)系

表 1 5195B 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)性對照，通過檢測熒光素酶活性，得到藥物在 BMP2 表達上調(diào)劑模型上的量效關(guān)系曲線（圖 2），表明其在 0.1 ～10 μmol/L 濃度范圍內(nèi)以劑量依賴方式增加模型細胞表達熒光素酶，EC50= 1.911 μmol/L。

2.3 5195B 對 MG63 細胞 BMP2 表達水平的影響

實時定量 PCR 和流式細胞實驗分別從 mRNA 和蛋白水平驗證了 5195B 上調(diào) BMP2 表達的作用。在設(shè)定劑量下，5195B 處理 MG63 細胞的 BMP2 mRNA 和蛋白水平明顯升高，藥物上調(diào)活性與劑量呈正相關(guān)，在 10 μmol/L濃度下可分別上調(diào) 2.56 倍和 2.28 倍（圖 3、圖 4）。

2.4 5195B 對成骨細胞的促分化作用

堿性磷酸酶（ALP）活性增強及細胞外基質(zhì)鈣化是成骨細胞分化的兩個重要標志。ALP活性檢測結(jié)果顯示，5195B在一定劑量下能上調(diào)細胞分泌的 ALP 水平。20 μmol/L 濃度條件下有最大的上調(diào)活性（P＜ 0.01），而繼續(xù)升高藥物濃度則對 ALP 活性提高沒有幫助（圖 5）。鈣化結(jié)節(jié)形成實驗則更直接地證明了 5195B 的體外促成骨細胞分化作用，在 10 μmol/L 和 20 μmol/L 濃度下，與空白對照組相比，鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)目均有顯著性升高（表 2）。

圖 3 5195B 對 bmp2 mRNA 表達的影響

圖 4 5195B 對 BMP2 蛋白表達的影響

圖 5 5195B 對細胞分泌 ALP 活性的影響

表 2 5195B 對成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

3 討論

從諾卡菌屬新種菌株 04-5195 發(fā)酵產(chǎn)物中提取得到5195B，經(jīng)鑒定與大豆素結(jié)構(gòu)相同。研究發(fā)現(xiàn)，大豆素在以bmp2啟動子為靶點的 BMP2 上調(diào)劑篩選模型上有確切的活性，在 MG63 細胞上的試驗驗證了大豆素上調(diào) BMP2表達的作用。進一步在 hFOB 細胞上的研究證明，大豆素有體外促成骨細胞分化作用，這與文獻報道 BMP2 在骨形成中的關(guān)鍵促進角色相一致。已知 BMP2 主要從兩方面促進骨形成：一是直接促進成骨細胞分化[3]。BMP2 在骨的再生和修復過程中能促進成骨細胞分化并抑制其凋亡[4]。BMP2 可募集并誘導骨髓干細胞分化為成骨細胞及軟骨細胞以及通過環(huán)磷酸腺苷（cAMP）誘導間充質(zhì)細胞不可逆地分化為骨細胞并重塑幼骨。二是 BMP2 能增加成骨細胞標志基因OPN，Cbfa1，Col I alpha1，BSP，ALP，fabp4等的表達[5-6]，這些基因的相應蛋白在成骨細胞分化中起非常關(guān)鍵的作用。大豆素能上調(diào) BMP2 表達，這可能是其促成骨細胞分化作用的分子機制之一。但成骨細胞分化受多因素綜合影響，BMP2 相關(guān)信號通路尚未完全清楚。大豆素促骨形成作用更詳盡的機制、及其上調(diào) BMP2 表達的直接作用位點尚有待更深入的研究。

大豆素是一種植物雌激素，具有異黃酮類結(jié)構(gòu)。該類結(jié)構(gòu)化合物常具有預防心血管疾病、清除氧自由基、抗癌、舒緩婦女更年期癥狀、預防骨質(zhì)疏松等保健作用[7-8]，其中，染料木素、依普黃酮、紅曲米提取物被明確報道有促進BMP2 生物活性的作用[9]，依普黃酮已在臨床上被用于改善骨質(zhì)疏松引起的骨量減少方面的治療。植物雌激素防治骨質(zhì)疏松的經(jīng)典機制是其選擇性作用于雌激素受體，在骨組織表現(xiàn)出雌激素樣作用，最終通過減少破骨細胞生成或抑制破骨細胞活性來抑制骨吸收, 防止骨量過多丟失。本工作證明大豆素上調(diào) BMP2 表達并能在體外促進成骨細胞分化，這為從不同角度理解該類化合物改善骨質(zhì)代謝的作用機制提供了證據(jù)。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.015

國家自然科學基金（30901811）

150040 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院（孫銀鈴、孫海峰）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點室（賀曉波、李永臻）

孫海峰，Email：shf120@sina.com

2012-03-16

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