李 峰，趙 萍，周昌豹，宋 萍，張蓓蓓

（四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130）

郫縣豆瓣是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表，歷史悠久，為中華傳統(tǒng)生物食品產(chǎn)業(yè)之瑰寶，是源自中國(guó)本土的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，是全國(guó)著名的地理標(biāo)志產(chǎn)品。郫縣豆瓣因紅潤(rùn)光亮、醬香濃郁、味辣香醇、瓣粒酥脆、黏稠絨實(shí)等優(yōu)點(diǎn)受到消費(fèi)者青睞，堪稱川菜之魂。其依賴四川優(yōu)越的氣候、地理、環(huán)境、人文、飲食條件及獨(dú)創(chuàng)性的生產(chǎn)技藝，歷經(jīng)300多年的演變、沉淀、錘煉、升華，自成一家、長(zhǎng)盛不衰，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)和同行的廣泛關(guān)注與認(rèn)同。非物質(zhì)文化遺產(chǎn)郫縣豆瓣于2000 年4 月21 日獲得國(guó)家工商總局商標(biāo)局批準(zhǔn)的“郫縣豆瓣”地理標(biāo)志證明商標(biāo)，并獲得中國(guó)馳名商標(biāo)等榮譽(yù)稱號(hào)。目前郫縣豆瓣從傳統(tǒng)的烹飪調(diào)料發(fā)展到系列復(fù)合調(diào)味品：火鍋底料、燒菜調(diào)料、魚(yú)調(diào)料、飯掃光、佐料系列等新產(chǎn)品，銷售遍布全國(guó)各省、市，并出口美國(guó)、加拿大、新西蘭、日本等國(guó)家。

1 材料和試劑

豆瓣樣品：從郫縣豆瓣生產(chǎn)企業(yè)采集樣品。

培養(yǎng)基：菌落分離采用PDA培養(yǎng)基；菌種鑒定采用察氏培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯削皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過(guò)濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000mL，pH值自然，121℃菌20min。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，氯化鉀0.5g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，加熱溶解，分裝后121℃滅菌20min。

固體培養(yǎng)基：按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1 MPa滅菌45min。

主要試劑：福林試劑（Folin試劑）、二硝基水楊酸（DNS）試劑均為實(shí)驗(yàn)室自配、Tris-HCl，EDTA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒等；蠶豆、麩皮、豆粕均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；其他試劑均購(gòu)自成都百旺化學(xué)試劑公司。

2 儀器和設(shè)備

主要儀器：752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH-600（0）型電子恒溫水浴鍋，LXJ-II離心沉淀機(jī)，PHS-3C型精密pH計(jì)，LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，XS-18型光學(xué)顯微鏡，Bio-rad PCR儀，Thermo小型離心機(jī)，電泳儀，搖床，超凈工作臺(tái)。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

3.1 米曲霉的分離純化

無(wú)菌條件下，將曲搗碎，稱取適量樣品，選取適宜的稀釋度用生理鹽水稀釋，采用含青霉素100單位/mL的PDA培養(yǎng)基，采用稀釋涂布平板法。每個(gè)稀釋接種3個(gè)平板，放置于30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至48h，進(jìn)行觀察，將菌落形態(tài)不同的菌種分離，各自傳代培養(yǎng)，至少進(jìn)行3次傳代分離，得到純化菌種，保存菌種備用。

3.2 高酶活米曲霉的篩選

將純化好的單個(gè)菌株接入到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1MPa滅菌45min，冷卻后分別接入菌種，在30℃恒溫培養(yǎng)72h。以酸性蛋白酶、中性蛋白酶和淀粉酶活力作為復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出酶活相對(duì)較高的米曲霉菌株。

3.3 菌種鑒定

對(duì)篩選出的菌株采用劃線平板培養(yǎng)后進(jìn)行培養(yǎng)特征的觀察。菌體特征及孢子結(jié)構(gòu)觀察從菌落上挑取菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，制普通玻片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察；根據(jù)篩選菌株的菌落、菌絲、抱子形態(tài)顯微鏡照片特性進(jìn)行鑒定。

3.4 酶活力測(cè)定

3.4.1 蛋白酶測(cè)定方法

粗酶液制取方法：上述制得固體曲樣品中按重量加入1:20（w/v）的緩沖溶液，于40℃水浴中浸提1h，間歇攪拌，過(guò)濾得粗酶液。此粗酶液用于各種蛋白酶酶活性測(cè)定。

酶活測(cè)定方法：采用福林酚法。

3.4.2 淀粉酶測(cè)定

樣品處理：酶液提取方法同蛋白酶測(cè)定，取5mL粗酶液，在7000r/min離心30min，吸取上清液測(cè)定酶活性。

酶活測(cè)定方法：參照SOMOGYI M的方法進(jìn)行測(cè)定。

3.5 菌株DNA的提取

（1）取適量菌絲，加入500mL 5×CTAB，再加適量的玻璃珠，漩渦振蕩器上高速振蕩4min～5min。

（2）65℃保溫20min，每隔10min搖勻1次。

（3）加入等體積氯仿:異戊醇（24:1，v/v），12000r/min離心10min。

將上清液移入新的離心管中，重復(fù)此步驟。

（4）在上清中加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20min～30min，12000r/min離心10min。

（5）倒掉上清，加70%vol的酒精200mL洗沉淀，室溫干燥。

（6）加入100mL TE使DNA完全溶解；加入RNase A（10mg/mL），65℃保溫30min。

（7）重復(fù)步驟4～6。最后DNA 溶于30mL超純水。

3.6 PCR擴(kuò)增

根據(jù)真菌整個(gè)ITS區(qū)設(shè)計(jì)通用引物序列為：

正向引物：ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’反向引物：ITS5：5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，以霉菌的DNA基因組為模板，擴(kuò)增ITS序列。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

3.7 PCR產(chǎn)物的電泳

進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。90V電壓條件下，電泳40min。

4 結(jié)果分析

4.1 酶活力測(cè)定

將篩選出的菌種ddQ-125和jcQ-93進(jìn)行蛋白酶活力和淀粉酶活力測(cè)定，對(duì)照菌是市售曲精C結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 米曲霉菌種的酶活力Fig.1 Enzyme activity of the Aspergillus oryzae strain

由圖1可知，菌株ddQ-125酸性蛋白酶活力最強(qiáng)，菌株jcQ-93的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力較菌株最強(qiáng)，酶活力均高于對(duì)照市售曲精C。

4.2 菌種的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)平板篩選和分離純化，從郫縣豆瓣生產(chǎn)企業(yè)收集樣品中分離篩選出2株霉菌，編號(hào)為ddQ-125和jcQ-93。

圖2 菌種的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strains

菌株ddQ-125和jcQ-93的菌落、菌絲和抱子形態(tài)如圖2，在PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，產(chǎn)出黃色或黃綠色孢子，菌落表面絮狀、邊緣白色絨毛狀。菌落蔓延迅速，初為白色，后變成黃綠色或黃褐色。背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。分生抱子梗自基質(zhì)中伸出，分生孢子穗半圓形，小梗1層或2層；頂囊半球形、圓拱形以至球形；分生孢子球形。通過(guò)形態(tài)和顯微觀查結(jié)果，初步鑒定這兩株菌為米曲霉。

4.3 PCR反應(yīng)結(jié)果

將反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖緩沖系統(tǒng)，90V電壓條件下，電泳40min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄。所有菌株都產(chǎn)生單一的明亮條帶，且所有的條帶均為所需條帶的長(zhǎng)度，正好為目的片段的長(zhǎng)度，見(jiàn)圖3。

圖3 菌株ddQ-125和jcQ-93的rDNA-ITS部分序列的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electropherogram of strain ddQ-125 and jcQ-93 partial sequences of rDNA-ITS PCR amplification

4.4 菌株的ITS序列分析

4.4.1 ddQ-125菌株擴(kuò)增ITS部分基因序列

CGAAGGACATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAG CCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTG TACCTTAGTT G CTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGG GCTCTCAGCCCCGGGC CCGCGCCCGCCGGAGACA CCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTT GATTGTA TCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATG GATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCG TGAATCATCGAGTCTTTGAACG CACATTGCGCCCC CTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCA TTGCTGCCCATC AAGCACGGCTTGTGTGTTGGGT CGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAG GCA GCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTAT GGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCC GGCCGGC GCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGG ATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAG GGAGGAAA

4.4.2 jcQ-93菌株擴(kuò)增ITS部分基因序列

CTACCTGATCCGAGGTCACCTGGAAAAAGGATGAT TTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGG CCTACAGAGC GGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACG CGGTGCCGCCGCTGC CTTTGGGGCCCGTCCCCCCC GGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGC TTGAT GGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCC CCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGT TCAAA GACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTA GTTATCGCATTTCGCTGCG TTCTTCATCGATGCCGG AACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATT GCGATA AATCAACTCAACTTCACTAGAATCAGACA GAGTTCGTGGTGTCTCCGGCG GCGCGGGCCCGGGG CTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCG CCGAAGCAACTAAGGTACAG TAAACACGGGTGGG AGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAAT GATCCTTCCGC AGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTA CG

采用真菌通用R/F引物擴(kuò)增米曲霉ITS部分序列。經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)一步鑒定其中ddQ-125和jcQ-93菌株確屬于Aspergillus oryzae；將測(cè)得的A、B菌株的ITS序列在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)。結(jié)果顯示，兩菌株與米曲霉的ITS序列相似性達(dá)到99%以上。

5 結(jié)論

從郫縣豆瓣中分離篩選出得到兩株優(yōu)勢(shì)菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的特性，鑒定為米曲霉，本研究采用真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行ITS序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genbank進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果顯示菌株ddQ-125和jcQ-93的序列與Genballk已知序列相似率可達(dá)99%以上。霉菌的序列分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定基本一致。新分離的高酶活菌株將用于郫縣豆瓣復(fù)合菌制曲的研究。

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