任 丹，陳 曦，李娟娟，馮 鎮(zhèn)*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品資源豐富，主要有豆醬、豆豉、醬油和腐乳等[1]。許多大豆發(fā)酵食品多以傳統(tǒng)的方式進(jìn)行生產(chǎn)，因而存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。過(guò)長(zhǎng)的成熟期會(huì)導(dǎo)致較高的生產(chǎn)成本。為了縮短傳統(tǒng)發(fā)酵食品的成熟周期，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量研究，主要途徑為提高成熟溫度、使用經(jīng)過(guò)修飾的發(fā)酵劑、添加輔助發(fā)酵劑或是直接添加蛋白酶，而在這些途徑中，使用蛋白酶來(lái)縮短發(fā)酵周期被認(rèn)為是最簡(jiǎn)單和行之有效的方法[2-5]。研究表明，對(duì)于具體的發(fā)酵食品而言，使用非固有發(fā)酵劑雖然可以達(dá)到促進(jìn)成熟的目的，但往往改變了產(chǎn)品的特征質(zhì)構(gòu)與風(fēng)味[6]。對(duì)于外源酶的使用也存在相同的問(wèn)題。因此，為了不改變傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特征質(zhì)構(gòu)與風(fēng)味，研究者往往是從發(fā)酵食品中篩選具有良好發(fā)酵特性的固有發(fā)酵劑菌株或是利用來(lái)源于固有發(fā)酵劑菌株的酶，進(jìn)行發(fā)酵食品的促熟研究。發(fā)酵食品特征風(fēng)味的形成是一個(gè)復(fù)雜生物化學(xué)反應(yīng)的綜合結(jié)果，包括由發(fā)酵微生物導(dǎo)致的糖酵解、脂肪水解和蛋白水解。對(duì)于發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特性而言，蛋白水解無(wú)疑是最重要的生化過(guò)程[7]。因此，發(fā)酵食品成熟的實(shí)質(zhì)之一是參與發(fā)酵的微生物所分泌蛋白酶作用于蛋白質(zhì)的結(jié)果。微生物所分泌的蛋白酶水解食品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸和肽，同時(shí)賦予發(fā)酵食品特征的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。因此，研究參與食品發(fā)酵微生物所分泌蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于微生物及其蛋白酶的應(yīng)用至關(guān)重要。

在前期工作中，從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳中篩選出一株可以水解大豆蛋白的細(xì)菌，本研究是在此基礎(chǔ)上對(duì)該菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。就酶制劑應(yīng)用于傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品而言，由于純酶制劑的價(jià)格較高，因此限制了其的應(yīng)用[8]。而粗酶的價(jià)格相對(duì)低廉更利于其推廣應(yīng)用。因此，在本研究中對(duì)該菌蛋白酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，目的是為通過(guò)酶法促進(jìn)大豆發(fā)酵食品的成熟奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株F1來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院保藏。菌株的活化培養(yǎng)基為胰蛋白酶消化大豆肉湯（TSB）（Becton，Dickinson and Co.，Sparks，USA）培養(yǎng)基。菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含6%（w/v）脫脂乳粉的胰蛋白酶消化大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基。其他生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Bia-Rad電泳儀：美國(guó)Bia-Rad有限公司；T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDL-40B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；ZWY-2102C/1102C型搖床培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BX51-P型顯微鏡：奧林巴斯。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及分子生物學(xué)鑒定

形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察參照文獻(xiàn)[9]。將經(jīng)過(guò)活化的菌株F1接種于滅菌的TSB液體培養(yǎng)基中，30℃搖瓶發(fā)酵12h。試劑盒法提取細(xì)菌的總DNA，以總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增細(xì)菌的16s rDNA序列，測(cè)定該序列并進(jìn)行同源性分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。所用的引物為細(xì)菌通用引物[27f（5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′）和1512r（5′-ACGGCTACCTT GTTACGACT-3′）]。

1.3.2 粗酶液的制備及蛋白酶分子量的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)活化的菌株F1接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)3d。4℃、12000r/min離心10min，除去菌體得粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩５鞍酌阜肿恿康臏y(cè)定通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法[10]。采用不連續(xù)系統(tǒng)，5%濃縮膠，12%分離膠，電泳緩沖液為Tris甘氨酸緩沖溶液（pH 8.0），加樣液與載樣液等量混合，煮沸2min～3min，考馬斯亮蘭染色。將粗酶液與上樣緩沖溶液混合，在進(jìn)行電泳之前樣品不經(jīng)歷任何加熱處理。電泳后將凝膠浸沒(méi)于含有2.5%（v/v）Triton X-100的100mmol/L glycine-NaOH（pH 9.0）緩沖溶液中，緩慢搖動(dòng)30min以除去SDS。用100mmol/L glycine-NaOH緩沖溶液（pH 9.0）清洗凝膠3次，以除去Triton X-100。在40℃的條件下，將凝膠在含有1%（w/v）酪蛋白的100mmol/L glycine-NaOH緩沖溶液（pH 9.0）中放置40min。最終用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色。

1.3.3 溫度對(duì)蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)蛋白酶活性的影響，在50mmol/L Tris-HCl的緩沖溶液（pH 7.0）中，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃時(shí)測(cè)定蛋白酶的活性，在進(jìn)行試驗(yàn)前將酶樣品和含有底物的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.0）培養(yǎng)到預(yù)定的溫度。對(duì)于蛋白酶熱穩(wěn)定性的研究，將酶樣品分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃的條件下培養(yǎng)1h，然后在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測(cè)定殘留的酶活力，未進(jìn)行熱處理的酶樣品作為空白。

1.3.4 pH值對(duì)蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

在pH 5.0～13.0的范圍研究pH值對(duì)蛋白酶活性的影響，應(yīng)用濃度為50mmol/L檸檬酸鈉（pH 5.0）、磷酸鉀（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl（pH 7.0～9.0）、硼酸鈉（pH 9.0～10.0）和甘氨酸-氫氧化鈉（pH 11.0～13.0）的緩沖溶液。pH值對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響，將蛋白酶在上述不同pH值的緩沖溶液中于30℃的條件下培養(yǎng)1h，在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測(cè)定殘留的蛋白水解活力。

1.3.5 NaCl和乙醇對(duì)蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

在NaCl濃度為0～15%（w/v）和乙醇濃度為0～8%vol的條件下研究NaCl和乙醇對(duì)酶活力的影響，在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測(cè)定酶活力。NaCl和乙醇對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響，酶在30℃的條件下于上述不同濃度的乙醇和NaCl溶液中培養(yǎng)1h。在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測(cè)定殘留的酶活力。未經(jīng)NaCl和乙醇處理的酶樣品作為空白。

1.3.6 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響

10mmol/L MgCl2、CaCl2、KCl、ZnCl2、FeSO4和MnCl2被用來(lái)研究金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響。在進(jìn)行試驗(yàn)之前，酶的樣品與金屬鹽在30℃培養(yǎng)60min。在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測(cè)定殘留的酶活性。未經(jīng)金屬鹽處理的酶樣品作為空白。

1.3.7 蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[11]，以酪蛋白為底物。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及分子生物學(xué)鑒定

圖1 菌株F1水解大豆蛋白與菌落及菌體形態(tài)圖Fig.1 Hydrolyzed soy protein,colony and cell morphology of F1

從我國(guó)傳統(tǒng)的腐乳中篩選出一株對(duì)大豆蛋白有較強(qiáng)水解活性的細(xì)菌F1，在大豆蛋白瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生的水解現(xiàn)象見(jiàn)圖1A。菌株F1的菌落和菌體的形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)圖1B和圖1C。菌株F1在TSB平板上菌落光滑、濕潤(rùn)、橙黃色、邊緣整齊。采用革蘭氏染色顯微鏡下觀察，細(xì)胞為球形、無(wú)芽孢、過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性。菌株F1的16S rDNA測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2，在Genebank中進(jìn)行序列的同源性比對(duì)，與模式菌株Staphylococcus carnosusATCC 51365T（AB009934）的16S rDNA序列的同源性為99.7%，因此確定菌株F1為肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）。肉葡萄球菌是凝固酶陰性球菌的一種常見(jiàn)菌株（Coagulase-negative cocci，CNC），這類細(xì)菌廣泛的存在于各種發(fā)酵食品中[12]。因CNC具有亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶活性，因此可以抑制脂質(zhì)氧化和食品的腐敗。CNC具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可以將食品中的蛋白質(zhì)水解為肽和游離氨基酸，而這些小分子物質(zhì)是許多發(fā)酵食品的重要風(fēng)味物質(zhì)或是風(fēng)味物質(zhì)的前體，同時(shí)賦予發(fā)酵食品特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味[13]。因此這類細(xì)菌作為食品發(fā)酵劑而被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)。

圖2 菌株F1的16S rDNA序列Fig.2 16S rDNA sequence of strain F1

2.2 粗酶液的制備及蛋白酶分子量的測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)方法中的方法進(jìn)行粗酶液的制備，以酪蛋白為底物在標(biāo)準(zhǔn)的條件下進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定，粗酶液的蛋白水解活力為83.87U/mL。SDS-PAGE 顯示該蛋白酶的分子量約為45ku。用酪蛋白作底物，在電泳圖中出現(xiàn)一條透明的條帶，說(shuō)明該酶具有較強(qiáng)的蛋白酶活性。

圖3 蛋白酶分子量的測(cè)定Fig.3 Electrophoretic analysis of protease molecular weight

2.3 溫度對(duì)蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)蛋白酶催化活性和穩(wěn)定性影響結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶在30℃～50℃時(shí)（相對(duì)酶活力＞50%）表現(xiàn)出較高的催化活性，蛋白酶的最佳催化溫度為40℃，此時(shí)的酶活力為92U/mL。就酶的穩(wěn)定性而言，當(dāng)酶在不同溫度經(jīng)歷1h的處理時(shí)，蛋白酶在20℃～50℃時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活力（殘留蛋白酶活力＞80%），而當(dāng)溫度為70℃時(shí)相對(duì)殘留酶活力僅為2%，因此該酶具有較低的耐熱性。多數(shù)發(fā)酵豆制品的發(fā)酵溫度為30℃，在本研究中的蛋白酶在30℃～50℃時(shí)顯示出較高的催化活力和穩(wěn)定性，因此，該蛋白酶適合于應(yīng)用通過(guò)提高發(fā)酵溫度或者是酶法生產(chǎn)發(fā)酵豆制品而促進(jìn)發(fā)酵豆制品的成熟。此外，該酶具有較低的耐熱性，可以通過(guò)較高的熱處理溫度使其失活，從而防止其在應(yīng)用過(guò)程中造成過(guò)度成熟。

圖4 溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of the protease

2.4 pH值對(duì)蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶在pH 7.0～11.0（相對(duì)酶活力＞50%）表現(xiàn)出較高的催化活力，最佳催化pH值為10.0，此時(shí)的蛋白酶活力為133U/mL。就pH值的穩(wěn)定性而言，當(dāng)酶在不同pH值條件下經(jīng)歷1h的處理時(shí)，在pH 7.0～11.0（殘留相對(duì)酶活力＞58%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白酶為堿性蛋白酶，并且在較寬的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性和穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明，該蛋白酶對(duì)pH值表現(xiàn)出的催化活性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)對(duì)于許多發(fā)酵大豆食品是非常重要的，因?yàn)槎鄶?shù)發(fā)酵大豆食品為堿性發(fā)酵食品，如kinema、Natto、Hawaijar、Thua nao、douche和sufu[14-16]。因此，就蛋白酶對(duì)pH值表現(xiàn)出的催化活性和穩(wěn)定性而言，該酶適合于應(yīng)用在大豆發(fā)酵食品中通過(guò)酶法或輔助手段進(jìn)行促熟。

圖5 pH值對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH value on the activity and stability of the protease

2.5 NaCl和乙醇對(duì)蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響

NaCl對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性和活力的影響見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)NaCl的濃度為0～1%時(shí)，蛋白酶的活力明顯增加。當(dāng)NaCl的濃度大于1%時(shí)，隨著NaCl濃度的不斷增加酶活力明顯下降。當(dāng)NaCl的濃度為9%時(shí)，蛋白酶的相對(duì)活力為66%，其蛋白酶的催化活力為33U/mL。就酶的穩(wěn)定性而言，當(dāng)NaCl的濃度小于9%時(shí)，蛋白酶相對(duì)殘留活力大于48%。乙醇對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性和活力的影響見(jiàn)圖7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白酶對(duì)乙醇表現(xiàn)出較高的活力和穩(wěn)定性，當(dāng)乙醇的濃度為8%vol時(shí)，蛋白酶的相對(duì)活力為76%。就酶的穩(wěn)定性而言，當(dāng)乙醇的濃度為8%vol時(shí)，其蛋白酶相對(duì)殘留活力仍為70%。研究結(jié)果表明，該酶對(duì)乙醇具有較強(qiáng)的耐受性。

圖6 NaCl對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of NaCl on the activity and stability of the protease

在發(fā)酵食品的成熟過(guò)程中，微生物所分泌的蛋白酶水解發(fā)酵基質(zhì)中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽和氨基酸，但由微生物產(chǎn)生的蛋白酶可能會(huì)被一些鹽或者是添加劑所抑制，因此研究酶對(duì)具體的添加劑的耐受性是十分必要的[17]。該蛋白酶對(duì)NaCl和乙醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，這是非常重要的特性對(duì)于在發(fā)酵豆制品中的應(yīng)用，如sufu、miso、koji和soy sauce等，為了獲得較好的風(fēng)味和抑制一些治病菌的生長(zhǎng)和繁殖，這些大豆發(fā)酵食品中往往在配料中加入較高濃度的NaCl和乙醇[18]。

圖7 乙醇對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of ethanol on the activity and stability of the protease

2.6 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響

幾種金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響見(jiàn)附表。在實(shí)驗(yàn)考查的6種金屬離子中Mg2+、Ca2+、K+、Fe2+和Zn2+增強(qiáng)了蛋白酶的催化活性，而Mn2+減弱了蛋白酶的催化活性。許多金屬離子可以影響蛋白酶的催化活性，超過(guò)75%的酶需要金屬離子作為激活劑才能表現(xiàn)出催化活力[19]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為該蛋白酶在大豆發(fā)酵食品工業(yè)中的應(yīng)用過(guò)程中通過(guò)金屬離子來(lái)調(diào)節(jié)酶的催化活力奠定了基礎(chǔ)。

附表 金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響Attached table Effects of metal ions on the activity of the protease

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的一株對(duì)大豆蛋白具有良好水解能力的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定并對(duì)其粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明該菌與模式菌株Staphylococcus carnosusATCC 51365T（AB009934）的16S rDNA序列的同源性為99.7%，因此確定菌株F1為肉葡萄球菌。電泳法測(cè)得菌株F1產(chǎn)蛋白酶的分子量約為45ku。菌株F1產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和10.0，在20℃～50℃和pH 7.0～11.0 范圍內(nèi)較穩(wěn)定。Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+和Zn2+對(duì)粗酶的催化活性有增強(qiáng)作用。粗酶對(duì)較高濃度的NaCl和乙醇表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。

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