楊 宓，朱 凱*

（南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

啤酒廢酵母一般指發(fā)酵4～6代后排入發(fā)酵罐內(nèi)的酵母泥，其含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸等物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，具有多方面的保健等[1-2]功能。其中，蛋白質(zhì)含量近50%，是一種廉價的蛋白質(zhì)資源；含有人體必需的8種氨基酸，其氨基酸比例接近于聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦比例，是一種寶貴的資源[3-4]。

中國是世界啤酒生產(chǎn)、消費(fèi)大國，每年在啤酒的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生4.5萬t左右的啤酒廢酵母，這些廢酵母除部分用作種子或經(jīng)粗加工制成飼料外，大部分被直接排放[5]，不但造成了資源的浪費(fèi)，而且增加了排水的BOD負(fù)荷[6-7]，嚴(yán)重污染了環(huán)境。所以對啤酒廢酵母進(jìn)行深加工，通過酶解制備氨基酸、核甘酸等高附加值的產(chǎn)品，這對于資源的綜合利用和環(huán)境保護(hù)都具有非常重要的意義。

本研究以啤酒廢酵母為原料，通過復(fù)合酶的酶解制備富含氨基酸的酶解液，主要利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對影響酵母酶解的關(guān)鍵因素進(jìn)行綜合考評，對酵母酶解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。研究有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

啤酒廢酵母：南京金陵啤酒廠；木瓜蛋白酶（酶活2.75×105U/g）、菠蘿蛋白酶（酶活4.06×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（酶活1.97×104U/g）、堿性蛋白酶（酶活1.18×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（酶活1.51×105U/g）、酵母抽提酶（酶活4.23×105U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；β-葡聚糖酶（酶活5.19×105U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

恒溫水浴振蕩器SHA-B（金壇市順華儀器有限公司），721分光光度計(jì)（上海航空測控技術(shù)研究所），pH計(jì)（上海雷磁），凱式定氮裝置。氨基酸分析儀（A200 amino Nova），噴霧干燥器ISO-1（天津大學(xué)北洋化工實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 分析檢測

1.2.1 蛋白酶活力測定

按Folin-酚法[8]進(jìn)行測定。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定

按凱氏定氮法[9]進(jìn)行測定。

1.2.3 氨基酸態(tài)氮得率測定

按甲醛滴定法[9]進(jìn)行測定。

1.2.4 水解度的計(jì)算

蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)的比值稱之為水解度（Degree of Hydrolysis，簡稱DH）。用凱氏定氮法分別測定水解上清液及水解前酵母泥中的蛋白質(zhì)含量，通過下式進(jìn)行計(jì)算[10]：

1.2.5 氨基酸分析

由江蘇省理化測試中心代為檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

酵母泥→水洗→0.5%NaHCO3脫苦→120 目篩分→離心→酵母泥→酶解→滅酶→離心→上清液

酵母泥用去離子水洗滌2～3次至基本沒有啤酒味，然后用0.5%NaHCO3的洗滌脫苦，再用去離子水清洗，并用120目的篩子篩分，除去酵母泥中的雜質(zhì)，然后添加酶和促溶劑NaCl酶解。酶解結(jié)束后95℃滅酶10min，離心，收集上清液，得到酵母酶解液。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶選擇

酵母細(xì)胞破碎程度加大有助于酵母細(xì)胞水解度的提高及水解液中氨基酸態(tài)氮得率的提高，細(xì)胞破碎的主要阻力來自于細(xì)胞壁。根據(jù)酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，在前期的實(shí)驗(yàn)中，比較了2種破壁酶：β-葡聚糖酶及纖維素酶分別與5種蛋白酶：酵母抽提酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶復(fù)合酶解的效果，初步選出酶解效果較好的4種復(fù)配酶組合：酵母抽提酶與β-葡聚糖酶、菠蘿蛋白酶與β-葡聚糖酶、菠蘿蛋白酶與纖維素酶以及復(fù)合蛋白酶與纖維素酶4種組合，通過單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，確定最適合復(fù)合酶種類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合效果最好，氨基酸態(tài)氮得率為4.25%、DH為73.45%；復(fù)合蛋白酶與纖維素酶復(fù)合效果次之，氨基酸態(tài)氮得率為4.21%、DH為72.59%；菠蘿蛋白酶與β-葡聚糖酶復(fù)合效果最差，氨基酸態(tài)氮得率僅為4.05%、DH為69.18%，菠蘿蛋白酶與纖維素酶復(fù)合與之差異不大。所以選擇酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合可以使細(xì)胞破碎程度較高，得到較多的小分子多肽及游離氨基酸。

表1 不同復(fù)合酶的酶解效果Table 1 Effect of different compound enzymes on enzymolysis

2.2 酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合酶解啤酒廢酵母工藝條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對酶解效果的影響

在pH值為6，酶添加量1.2%，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察酶解溫度對酶解效果的影響，見圖1。

圖1 溫度對酶解效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the enzymolysis

由圖1可知，酶解溫度對酶解效果影響十分顯著。開始時隨著酶解溫度的上升，氨基酸態(tài)氮得率及水解度均呈快速上升的趨勢；45℃后上升趨緩，50℃時酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮得率為4.20%，水解度為73.22%，且制得酶解液風(fēng)味比較醇厚；超過50℃后，氨基酸態(tài)氮得率明顯降低，水解度也呈緩慢降低的趨勢。這主要是由于低溫下酶的活性較低，溫度升高，酶的活性隨之上升，有利于酶解，但溫度過高會使酶由于變性而失活，不利于酶解。因此酶解溫度選擇50℃較為適宜。

2.2.2 pH值對酶解效果的影響

在溫度50℃，酶添加量1.2%，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察pH值對酶解效果的影響，見圖2。

由圖2可知，pH值＜5時，氨基酸態(tài)氮得率和水解度呈上升趨勢；當(dāng)pH值為5時，水解度達(dá)到最大，為73.72%；當(dāng)pH值＞5時，水解度緩慢降低，而氨基酸態(tài)氮得率繼續(xù)提高，pH值為6時，氨基酸態(tài)氮得率最大，為4.35%；當(dāng)pH值＞6時，水解度和氨基酸態(tài)氮得率均呈明顯下降趨勢。這是因?yàn)槊傅幕钚允躳H值影響較大，在一定pH值范圍內(nèi)，酶的活性較高，能較好的把酵母的大分子肽鏈切斷成游離氨基酸和小分子肽鏈，超出這個pH值范圍（低于或者高于），酶的活性受到一定程度的抑制，酶解效果較差。因此，酶解的初始pH值調(diào)節(jié)為6比較適宜。

圖2 pH值對酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH value on the enzymolysis

2.2.3 酶的添加量對酶解效果的影響

在溫度50℃，pH值為6，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察酶的添加量對酶解效果的影響，見圖3。

圖3 酶的添加量酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on enzymolysis

由圖3可知，隨著酶添加量的不斷增加，氨基酸態(tài)氮得率和水解度都呈快速上升的趨勢，當(dāng)酶的添加量達(dá)1.2%后，上升趨緩。這主要是由于酶解反應(yīng)的初始階段，大分子蛋白質(zhì)不斷溶出，被分解為小分子多肽及游離氨基酸，氨基酸態(tài)氮得率及水解度不斷增加。當(dāng)細(xì)胞壁被打破到一定程度，大分子蛋白質(zhì)減少到一定程度，盡管酶的用量繼續(xù)增加，其與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合的幾率有限，氨基酸態(tài)氮得率及水解度增加的幅度已經(jīng)很小。因此從酶解效果及經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇酶的添加量為酵母泥干重的1.2%較為適宜。

2.2.4 酵母抽提酶與β-葡聚糖酶的配比對酶解效果的影響

在溫度50℃，pH值為6，酶添加量1.2%的條件下，考察復(fù)合酶的配比對酶解效果的影響，見圖4。

由圖4可知，酵母抽提酶與β-葡聚糖酶的配比為1:1，酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮得率及水解度均達(dá)到最大值，4.23%、72.95%，這說明酵母抽提酶與β-葡聚糖酶存在協(xié)調(diào)作用，二者并非某一種添加量偏多較好。選擇二者以等比例復(fù)合添加時，酶解的效果比較理想。

圖4 復(fù)合酶的配比對酶解效果的影響Fig.4 Effect of compound enzyme ratio on enzymolysis

通過4組單因素實(shí)驗(yàn)初步探索出符合酶解的較優(yōu)條件為：50℃條件下，酶解初始pH值為6.0，復(fù)配酶為酵母抽提酶與β-葡聚糖酶按1:1（質(zhì)量），添加量為1.2%（占酵母干重）酶解24h，制得的酶解液氨基酸態(tài)氮含量及蛋白質(zhì)水解度較高，風(fēng)味較醇厚。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法是一種采用二元回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法，適用于2～5個因素的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選擇溫度、pH值、復(fù)合酶配比進(jìn)行3因素的Box-Behnken擬合3水平實(shí)驗(yàn)，以水解度DH為優(yōu)化指標(biāo)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次擬合，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最終確定復(fù)合酶解的最佳條件。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface experimental design

2.3.2 二次回歸模型擬合

根據(jù)表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以水解度為響應(yīng)值，運(yùn)用STATGRAPHICS軟件中的DOE程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型。

2.3.3 方差分析

方差分析表明，模型的校正決定系數(shù)R2ADJ=0.908333，說明該方程能解釋90.83%的響應(yīng)值變化，僅有9.17%的響應(yīng)值不能用該模型解釋。模型的決定系數(shù)R2=0.959896，說明該模型的擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型是適合的，可以用來分析酵母酶解液的水解度DH。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 ANOVA of regression model

從表3的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型一次項(xiàng)X1（p=0.2030）、X2（p=0.0555）、X3（p=0.6982）均不顯著；二次項(xiàng)X12（p=0.0003）、X22（p=0.0002）、X32（p=0.0003）均極顯 著；交 互 項(xiàng)X1X2（p=0.1173）、X1X3（p=0.2394）、X2X3（P=0.1474）均不顯著。

3因素對酶解液氨基酸態(tài)氮得率影響的先后順序?yàn)椋篨2（復(fù)合酶配比）＞X1（溫度）＞X3（pH值）。

2.3.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形為響應(yīng)值（Y）對各實(shí)驗(yàn)因子X1、X2、X3所構(gòu)成第一個三維空間的曲面圖。從響應(yīng)面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及參數(shù)之間的相互作用。

圖5 酶解溫度和復(fù)合酶配比對DH的影響Fig.5 Effect of temperature and compound enzyme ratio on DH

由表4可知，酶解溫度和復(fù)合酶配比的交互作用不顯著X1X2（p=0.1173）。由圖5可以看出，固定復(fù)合酶配比，酶解溫度在49℃前DH（水解度）變化幅度較大，在49℃以后變化幅度較?。还潭附鉁囟?，隨著復(fù)合酶配比的增加DH成上升趨勢，接近1.0時，DH不再增加。

圖6 酶解溫度和pH值對DH的影響Fig.6 Effect of temperature and pH value on DH

由表4可知，酶解溫度和pH值的交互作用不顯著X1X3（p=0.2394）。由圖6可以看出，固定反應(yīng)溫度，隨著pH值的增加，DH呈上升趨勢，當(dāng)pH值達(dá)到6.1左右時，DH不再增加；固定pH值，隨著酶解溫度的升高，DH呈上升趨勢，當(dāng)酶解溫度接近50℃時，DH不再增加。

圖7 復(fù)合酶配比和pH值對DH的影響Fig.7 Effect of compound enzyme ratio and pH on DH

由表4可知，復(fù)合酶配比與pH交互作用不顯著X2X3（p=0.1474）。由圖7可以看出，固定pH值，復(fù)合酶配比在1.0之前DH的變化幅度較小，在1.0之后變化幅度較大；固定復(fù)合酶配比，隨著pH值的增加，DH呈上升趨勢，當(dāng)pH值達(dá)到6.1左右時，DH不再增加。

通過DOE數(shù)據(jù)處理，用二次多項(xiàng)式回歸分析求極大值，得到最大的水解度DH為73.39%，最佳酶解條件為：酶解溫度50.32℃，復(fù)合酶配比為0.94，pH值為5.98。在此工藝條件下經(jīng)過3次實(shí)際平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，DH的平均得率為73.84%，驗(yàn)證值與預(yù)測值十分接近，說明該響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)擬合較好，比較可靠。

2.4 游離氨基酸組分分析

采用A200 amino Nova氨基酸分析儀對最佳工藝條件下制備的酵母酶解液的組分及其含量進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見圖8、表5。

圖8 氨基酸分析圖譜Fig.8 Amino acids analysis map

表5 游離氨基酸分析Table 5 Analysis of free amino acids

由表5可知，由氨基酸分析儀檢測，經(jīng)過最佳工藝條件制備的啤酒廢酵母的酶解液中含有17種游離氨基酸，含量為38.73g/L酶解液。在總氨基酸中，人體所需的8種必需氨基酸（EAA）/總氨基酸（TAA）為44.18%；其中，在Maillard反應(yīng)中對肉味的產(chǎn)生貢獻(xiàn)較大的谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、蛋氨酸等氨基酸含量較高為35.55%；一些支鏈氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸含量為28.07%，而這些支鏈氨基酸目前被認(rèn)為可以預(yù)防和治療肝腦性疾病[10]。因此，啤酒廢酵母酶解液非常適合作為Maillard反應(yīng)的氨基酸源，不僅可以滿足對肉味香氣的需求，還兼具較高的營養(yǎng)價值和較好的保健功效。

3 結(jié)論

通過各種酶的復(fù)配及酶解實(shí)驗(yàn)，確定酶解效果最優(yōu)的復(fù)配酶組合為酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合。通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考查了溫度、pH值、酶的添加量及復(fù)合酶配比對酶解啤酒廢酵母酶解效果的影響，并通過溫度、復(fù)合酶配比及pH值3個因素對酶解條件進(jìn)行相應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果，模型的擬合度較好，可靠，得到啤酒廢酵母酶解的最佳工藝條件為：酶解溫度50.32℃，復(fù)合酶配比0.94（酵母抽提酶：β-葡聚糖酶），pH值為5.98，懸浮液濃度10%，NaCl添加量2%，酶解24h。在此條件下，DH模型預(yù)測值為73.39%，實(shí)測值為73.84%，實(shí)測值與預(yù)測值十分接近，證明所得回歸模型擬合較好，可以用來預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

所制備的酶解液中游離氨基酸種類及含量較為豐富，為38.73g/L酶解液，是進(jìn)行Maillard反應(yīng)制備肉味香精的優(yōu)質(zhì)氨基酸源。

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