許 謙

（菏澤學(xué)院 生命科學(xué)系，山東 菏澤 274000）

酸奶又稱酸乳，是以牛奶為主要原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而制成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、國(guó)際流行的保健飲料[1]。乳酸菌是能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的一群細(xì)菌[2]。根據(jù)乳酸菌對(duì)葡萄糖的發(fā)酵方式，可將乳酸菌分為異型發(fā)酵和同型發(fā)酵兩群。在異型發(fā)酵中，葡萄糖被發(fā)酵成乳酸、乙酸（乙醇）、CO2；在同型發(fā)酵中葡萄糖的發(fā)酵終產(chǎn)物絕大多數(shù)是乳酸[3]。乳酸菌可定植于人和動(dòng)物的器官中（如口腔、腸道、陰道等），使得乳酸菌與人類的健康密切相關(guān)。乳酸菌的有益作用包括：乳酸菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，乳酸菌的營(yíng)養(yǎng)及代謝作用，乳酸菌的抗菌作用，乳酸菌脫除真菌毒素的作用，乳酸菌對(duì)某些疾病的治療作用及對(duì)癌癥的預(yù)防作用[4-5]。

常用于酸奶發(fā)酵劑的乳酸菌主要包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬等。乳桿菌屬細(xì)胞形態(tài)多樣，成細(xì)長(zhǎng)桿狀、短桿狀，一般形成鏈；一般不運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)則有周生鞭毛。無(wú)芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性；微好氧，化能異養(yǎng)型，如保加利亞乳桿菌，能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生適口性差的D-型乳酸。不能利用蔗糖，是產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的乳酸菌菌種[6]。鏈球菌是指那些常成鏈狀排列、兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌。一般不運(yùn)動(dòng)，化能異養(yǎng)型，如嗜熱鏈球菌能利用乳糖進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生適口性好的L-型乳酸[7]。雙歧桿菌的細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)。不運(yùn)動(dòng)，化能異養(yǎng)型，專性厭氧[8]。

酸奶主要使用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為發(fā)酵劑。除了這種傳統(tǒng)發(fā)酵劑之外，越來(lái)越多的試驗(yàn)揭示了益生菌對(duì)健康的有益作用，由于酸奶是攝入益生菌的良好載體，因此在酸奶發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)加入各種益生菌，如雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在合適的分離培養(yǎng)基中從酸奶分離出保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、和雙歧桿菌，反復(fù)劃線進(jìn)行純化后鏡檢并用生理生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，而得到純菌種。以嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌與雙歧桿菌的純菌種制成發(fā)酵劑，稀釋涂布平板測(cè)得3種發(fā)酵劑的菌數(shù)，并根據(jù)其配成不同比例接種到10%脫脂乳液，在43℃恒溫培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定在不同發(fā)酵時(shí)間的酸度，對(duì)酸奶進(jìn)行感官品質(zhì)的檢查，從而找出最佳的乳酸菌配方。

1 材料與方法

1.1 原料

蒙牛冠益乳。

1.2 試劑、儀器

1.2.1 試劑

結(jié)晶紫染色液、碘液、95%vol乙醇、番紅、75%vol乙醇、香柏油、95%vol乙醇、香柏油、10%NaOH溶液、0.9%生理鹽水、焦性沒(méi)食子酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的脫脂乳液、改良TJA培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基。

1.2.2 儀器

電子天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、單人單面紫外線誘變臺(tái)、美的多功能電磁爐、MLS-3780高壓蒸汽滅菌器、BL-100G型立式壓力蒸汽滅菌器、精密酸度計(jì)、YQX-2J型厭氧培養(yǎng)箱、接種環(huán)、試管、標(biāo)簽、記號(hào)筆、500mL錐形瓶、250mL錐形瓶、150mL錐形瓶、、厭氧罐、恒溫水浴鍋、堿式滴定管、培養(yǎng)箱、冰箱、、藥匙、光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、電爐、石棉網(wǎng)、玻璃涂棒、吸管、棉塞、線繩、pH試紙、500mL量筒、250mL量筒、100mL量筒、培養(yǎng)皿、漏斗、500mL燒杯、250mL燒杯、酒精燈。

1.3 方法

1.3.1 改良TJA培養(yǎng)基的制備（用于分離嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）

配方：番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，K2HPO42g，吐溫80 1mL，乙酸鈉5g，瓊脂15，加水至1000mL；pH 6.8±0.2。

制法：將上述成分加入蒸餾水，加熱溶解，定容，校正pH 6.8±0.2，分裝三角燒瓶，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.3.2 TPY培養(yǎng)基的制備（用于分離雙歧桿菌）

配方：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化鈉5.0g，5%半胱氨酸10.0mL，西紅柿浸出液400.0mL；吐溫80 1.0mL；肝提取液80.0mL；瓊脂20.0g；蒸餾水520.0mL；pH 7.0。

制法：西紅柿浸出液的制備：將新鮮的西紅柿洗凈、稱量、切碎后，加等量蒸餾水在100℃水浴中邊加熱邊攪拌約90min然后用紗布過(guò)濾，校正pH 7.0，分裝三角燒瓶，115℃高壓滅菌15min。

肝提取液的制備：稱取新鮮豬肝1000g，切碎加蒸餾水至2000mL并混勻放在冰箱中過(guò)夜。第2d煮沸15min～20min后用紗布過(guò)濾，收集全部濾液，加水補(bǔ)足原量。分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15min。

將上述成分加入1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值，分裝三角燒瓶后115℃高壓滅菌15min～20min。

1.3.3 各菌種分離（稀釋涂布平板法）

（1）倒平板：將改良TJA培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻至55℃～60℃時(shí)倒平板，每種培養(yǎng)基倒6皿。

（2）編號(hào)：取7無(wú)菌試管，依次編號(hào)為10-1，10-2，10-3，……10-7；再取18套無(wú)菌培養(yǎng)皿，依次編號(hào)為10-6、10-7，各稀釋梯度作三個(gè)重復(fù)。

（3）制備酸奶稀釋液：取1mL酸奶于9mL無(wú)菌生理鹽水，充分混合使細(xì)胞分散，制成10-1稀釋液。再用一支1mL無(wú)菌吸管吸取1mL上述稀釋液于盛有9mL滅菌生理鹽水的編號(hào)10-2的試管內(nèi)，以此類推制成10-3，10-4……10-7稀釋液。

（4）取樣：1mL無(wú)菌吸管吸取10-6，10-7稀釋液0.1mL于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中間。

（5）涂布：用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕的涂布均勻。

（6）培養(yǎng)：將平板置于厭氧罐在42℃培養(yǎng)48h。

（7）挑菌落：將長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，須再次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單菌落挑取少數(shù)菌苔接種在相應(yīng)培養(yǎng)基的斜面上進(jìn)行菌種保藏。

1.3.4 菌種鑒定

將分離純化的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，確定是否分離了純菌種。

1.3.5 酸奶制作

（1）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%脫脂乳液的制備：在3個(gè)500mL的錐形瓶中，分別稱取30g脫脂奶粉于270mL蒸餾水中，配成10%的脫脂乳液。在14個(gè)150mL錐形瓶中，分別取15g脫脂奶粉于135mL蒸餾水中，配成10%的脫脂乳液。將其在高壓蒸汽鍋內(nèi)105℃滅菌15min。

（2）發(fā)酵劑的制作：將分離得到的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌按3%的接種量分別接種于3個(gè)裝有滅菌脫脂乳的錐形瓶中，用保鮮膜密封好后置于42℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）發(fā)酵劑的菌種計(jì)數(shù)：用稀釋涂布平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將發(fā)酵劑樣品按十進(jìn)制稀釋后，取10-5、10-6兩個(gè)稀釋度0.1mL于相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基并用無(wú)菌玻璃涂布棒進(jìn)行涂布。將平板置于厭氧罐在42℃培養(yǎng)48h。每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。從而得到3種發(fā)酵劑的菌種數(shù)量。

（4）14種乳酸菌配方的制成：在超凈工作臺(tái)，根據(jù)3種發(fā)酵劑的菌種數(shù)量，搖勻發(fā)酵劑，取其相應(yīng)的體積制成14種乳酸菌配方接種到14個(gè)裝有滅菌脫脂乳的錐形瓶中，并編號(hào)。14種乳酸菌配方見(jiàn)表1，配制14種乳酸菌配方所吸取的3種發(fā)酵劑體積見(jiàn)表2。

（5）發(fā)酵：將14個(gè)錐形瓶用保鮮膜密封好，充分搖勻后放入42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔40min測(cè)定一次的pH值。做出其pH值隨時(shí)間變化的曲線。出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。

（6）后酸化：放入4℃冰箱中冷藏12h進(jìn)行后酸化。

（7）測(cè)定質(zhì)量指標(biāo)：測(cè)定酸奶的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)（酸度）和微生物指標(biāo)（大腸菌群數(shù)）。

感官指標(biāo)的測(cè)定：檢查酸奶的組織狀況，然后品嘗酸口感，聞其氣味是否有異常。鑒定由5人參加，每項(xiàng)指標(biāo)滿分以100分計(jì)，然后進(jìn)行加權(quán)處理。其中組織狀態(tài)35%、酸甜適口性35%、發(fā)酵乳香味10%、外觀色澤10%、口感10%，以評(píng)分員的平均評(píng)分為每份樣品的得分[9]。

表1 14 種乳酸菌配方Table 1 14 LAB formulas

表2 14 種乳酸菌配方所吸取的發(fā)酵劑體積Table 2 Culture absorption volumes of 14 LAB formulas mL

酸奶酸度的測(cè)定：測(cè)定酸奶的滴定酸度用吉爾涅爾度（°T）表示，取10mL酸乳，用20mL蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定，將所消耗的NaOH毫升數(shù)乘以10，即為酸奶的酸度[10]。其他各指標(biāo)按照乳品的常規(guī)檢驗(yàn)法進(jìn)行。

酸奶微生物指標(biāo)的測(cè)定：采用GB4789.3平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶中乳酸菌的菌落形態(tài)

在改良TJA培養(yǎng)基中，平皿底為黃色，培養(yǎng)基上有2種菌生長(zhǎng)。保加利亞乳桿菌菌落微白色，濕潤(rùn)，菌落較大，直徑（3±1）mm，邊緣不整齊，如棉絮團(tuán)狀菌落；嗜熱鏈球菌菌落光滑，微白色，濕潤(rùn)，菌落較小，邊緣整齊。見(jiàn)圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌菌落（大）和嗜熱鏈球菌菌落（?。〧ig.1 Colonies of L. bulgaricus (large) and S. thermophilus (small)

在TPY培養(yǎng)基中，平皿底為黃色，雙歧桿菌菌落白色，光滑，較小，突起，邊緣整齊，呈奶油色，瓷白色，柔軟，細(xì)膩。見(jiàn)圖2。

圖2 雙歧桿菌菌落Fig.2 Bifidobacterium colony

2.2 乳酸菌的鑒定

乳酸菌經(jīng)革蘭氏染色后均呈藍(lán)紫色，為陽(yáng)性菌。雙歧桿菌的細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)：有短桿狀形態(tài)規(guī)則或纖細(xì)桿狀具有尖細(xì)末端的細(xì)胞，也有長(zhǎng)而稍彎曲狀的、Y型或V形，見(jiàn)圖3。保加利亞乳桿菌為細(xì)長(zhǎng)桿狀，見(jiàn)圖4。嗜熱鏈球菌單個(gè)球形，呈鏈狀排列，見(jiàn)圖5。

圖3 雙歧桿菌Fig.3 Bifidobacterium spp.

圖4 保加利亞乳桿菌Fig.4 L. bulgaria

圖5 嗜熱鏈球菌Fig.5 S. thermophilus

2.3 三種發(fā)酵劑的菌落數(shù)

在改良TJA培養(yǎng)基上的保加利亞乳桿菌的平均菌落數(shù)為5.6×107cfu/mL，嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)為1.72×108cfu/mL；在TPY培養(yǎng)基的雙歧桿菌的菌落數(shù)為8.8×107cfu/mL。因此3種發(fā)酵劑中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌比例為1:3:1.5。

2.4 不同乳酸菌配方的脫脂乳發(fā)酵期間的變化

2.4.1 不同乳酸菌配方的脫脂乳在不同發(fā)酵時(shí)間的pH值變化

2.4.2 不同乳酸菌配方的脫脂乳pH值隨發(fā)酵時(shí)間變化的曲線

作1-14號(hào)配方脫脂乳的pH值隨時(shí)間變化的曲線，見(jiàn)圖6。

表3 不同乳酸菌配方的脫脂乳在不同發(fā)酵時(shí)間的pH 值Table 3 pH values of skimmed milk inoculated with different LAB formula at different fermentation times

由表3、圖6及觀察記錄得知，1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)相比，配方中只有保加利亞乳桿菌時(shí)凝乳最快，其次是只有嗜熱鏈球菌的脫脂乳，最后是雙歧桿菌脫脂乳。這是因?yàn)殡p歧桿菌較保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的營(yíng)養(yǎng)代謝能力相對(duì)較弱，生長(zhǎng)速度較慢，因此發(fā)酵所需時(shí)間比保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的長(zhǎng)[11]。在開(kāi)始階段，保加利亞乳桿菌較嗜熱鏈球菌pH值變化小，發(fā)酵速度慢。在大約90min后pH值變化快，發(fā)酵速度超過(guò)嗜熱鏈球菌。

圖6 不號(hào)乳酸菌配方的脫脂乳ph值隨時(shí)間變化的曲線Fig.6 pH change with time of skimmed milk inoculated with different LAB formulas

4、5、6號(hào)與1、2、3號(hào)相比，混合菌比單菌發(fā)酵速度快，凝乳快。這是因?yàn)槭葻徭溓蚓捅＜永麃喨闂U菌有很好的共生關(guān)系。當(dāng)2種菌按一定比例接種于牛乳中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，桿菌為球菌提供必需的肽和氨基酸，如亮氨酸組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸，而后者產(chǎn)生的甲酸和CO2又刺激了前者增殖[12]。

4、5、6號(hào)相比，7、8號(hào)相比，9、10號(hào)相比，可看出混合菌中，傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）與在其基礎(chǔ)上加入了雙歧桿菌的混合菌不同，pH值變化不同。4號(hào)凝乳速度最快，5號(hào)，6號(hào)較慢。7號(hào)較快，8號(hào)較慢。9號(hào)較快，10號(hào)較慢。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）與益生菌（雙歧桿菌）之間存在拮抗作用。雙歧桿菌能產(chǎn)生乳酸、乙酸及細(xì)菌素，傳統(tǒng)發(fā)酵劑除了會(huì)產(chǎn)生乳酸外，還會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫、雙乙酰及細(xì)菌素等。這些物質(zhì)的主要作用是抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)使傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑和益生菌之間相互抑制[11]。5號(hào)與6號(hào)相比，加入的雙歧桿菌的量不同，其發(fā)酵結(jié)果也不同，這是因?yàn)槲⑸镩g拮抗作用的程度不同。

在圖6中，10、11、12號(hào)與5、8、13、14相比，5、8、13、14號(hào)的發(fā)酵速度較快。因保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之間除了有共生關(guān)系之外，其間也存在著拮抗關(guān)系。由此可看出，混合菌中，球菌占優(yōu)勢(shì)時(shí)發(fā)酵速度較快。

2.5 酸奶的質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 酸奶的感官指標(biāo)

酸奶的感官指標(biāo)見(jiàn)表4。

2.5.2 酸奶的理化指標(biāo)

測(cè)得各配比條件下所生產(chǎn)酸奶的酸度見(jiàn)表5。

2.5.3 酸奶的微生物指標(biāo)

表4 酸奶的感官指標(biāo)Table 4 Sensory indexes of yogurt

表5 酸奶的理化指標(biāo)（酸度）Table 5 Physical and chemical indexes of yogurt (acidity)

測(cè)得各配比條件下所生產(chǎn)酸奶的微生物指標(biāo)大腸菌群數(shù)為0cfu/mL，滿足酸奶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

由表4、表5可以看出，采用5號(hào)配方，其組織狀態(tài)、氣味和口感比其他的配方都好一些，并且酸度適中。因此在本實(shí)驗(yàn)中采用的5號(hào)配方是生產(chǎn)酸奶的最佳配方，即保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌的比例為1:1:1。

3 討論

3.1 3種乳酸菌的分離

在冠益乳中，嗜熱鏈球菌占優(yōu)勢(shì)，保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌較少，分離較難。采用改良TJA培養(yǎng)基分離保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，因這2種菌在改良TJA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，且2種菌的菌落形態(tài)不同：保加利亞乳桿菌菌落微白色，濕潤(rùn)，菌落較大，直徑（3±1）mm，邊緣不整齊，如棉絮團(tuán)狀菌落；嗜熱鏈球菌菌落光滑，微白色，濕潤(rùn)，菌落較小，邊緣整齊。雙歧桿菌是專性厭氧菌，對(duì)環(huán)境要求和營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格，采用TPY培養(yǎng)基能很好地分離出雙歧桿菌。

3.2 不同乳酸菌配方對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

在酸奶發(fā)酵中，保加利亞乳桿菌凝乳最快，其次是嗜熱鏈球菌，雙歧桿菌最慢。

采用混合菌配方發(fā)酵酸奶的速度和口味等都優(yōu)于單菌種配方發(fā)酵的酸奶。

在傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑的基礎(chǔ)上加入了雙歧桿菌的配方發(fā)酵的酸奶的口味和營(yíng)養(yǎng)優(yōu)于傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶。加入雙歧桿菌的量不同，其口味稍有差別。

傳統(tǒng)發(fā)酵劑中不同的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌配方，其所發(fā)酵的酸奶的口味也不同。嗜熱鏈球菌占優(yōu)勢(shì)的配方所發(fā)酵的酸奶的口味較好。因保加利亞乳桿菌是產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的乳酸菌菌種[11]，若保加利亞乳桿菌占優(yōu)勢(shì)，則生產(chǎn)的酸奶酸度太大。

經(jīng)過(guò)綜合分析可知，在保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌的比例為1:1:1時(shí)更有利于形成風(fēng)味較好的酸奶。

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