莫蓓紅，孫立國

(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436)

非培養(yǎng)技術(shù)在干酪微生物群落分析中的應(yīng)用

莫蓓紅，孫立國

(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436)

非培養(yǎng)方法在食品行業(yè)中的應(yīng)用還處于起步階段。本文綜述非培養(yǎng)方法在分析干酪中微生物群落結(jié)構(gòu)以及監(jiān)測微生物群落結(jié)構(gòu)在干酪生產(chǎn)和成熟過程中演替的應(yīng)用現(xiàn)狀。主要介紹已被廣泛用于分析干酪中微生物群落結(jié)構(gòu)的DNA指紋圖譜技術(shù)，包括PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)、PCR-時間溫度梯度凝膠電泳(PCR-TTGE)技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(SSCP-PCR)技術(shù)以及變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)等。此外，本文還對非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性進(jìn)行分析，展望非培養(yǎng)方法在干酪行業(yè)的應(yīng)用前景，認(rèn)為將非培養(yǎng)方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合使用才是研究微生物生態(tài)的最好途徑。

非培養(yǎng)方法；干酪；DNA指紋圖譜技術(shù)；微生物群落

干酪的制作可追溯到8000年前，那時的中東人發(fā)明了世界上第一種牛奶發(fā)酵食品[1]。發(fā)展至今，干酪擁有1000多種不同的形式和口味，在世界各地都廣受歡迎[2]。絕大多數(shù)干酪都是由牛奶、凝乳酶、食鹽和微生物菌種這些基本原料通過酸化、凝乳、排乳清和成熟等工藝步驟制得的。特性不一的各類干酪就是通過不同的原料組合或者工藝參數(shù)改變得到的。微生物群落的組合和活性是所有這些參數(shù)中最不容易控制的。因?yàn)楦衫业奈⑸锶郝渲胁粌H包括乳酸菌發(fā)酵劑，而且還包括非發(fā)酵劑乳酸菌，其他細(xì)菌、酵母和絲狀真菌等二級微生物群落。二級微生物群落在干酪的制作和成熟過程中是不斷發(fā)展變化的，這對干酪的物理和化學(xué)特性的改變起到了很大的作用。由于干酪制作和成熟過程中的各個階段都會對其中的微生物組成形成選擇壓力，因此產(chǎn)生了微生物群落的演替[3]。雖然所有食品中微生物群落的多樣性都毋庸置疑的不及環(huán)境(例如土壤)中的微生物群落，但是復(fù)雜的動力學(xué)變化和相互作用使得干酪中的微生物群落變得難以控制。如果能夠充分了解干酪中微生物群落的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)變化，那么人們就能夠更加了解干酪中微生物的生長和代謝是如何改變干酪特性的。例如，通過控制微生物的組成或者改變其中某種或某些種類微生物的數(shù)量，以得到更佳的某種感官特性或者預(yù)防質(zhì)量缺陷和酸敗等。目前為止，人們已經(jīng)通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法以及少量的分子生物學(xué)技術(shù)對干酪中的細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行了部分鑒定。

同其他環(huán)境一樣，干酪中的微生物可以通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)法進(jìn)行種水平上的鑒定。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法要求必須先對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)，然后再通過菌落形態(tài)、生化特性或者基因特性進(jìn)行鑒定。經(jīng)過多年發(fā)展，基于培養(yǎng)的分析方法已經(jīng)在分析干酪制作過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮了重要的作用。然而，培養(yǎng)方法耗時很長，而且培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜繁冗，需要針對不同種類的微生物設(shè)計不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。因此無法勝任監(jiān)測干酪制作和成熟過程中微生物群落多樣性的任務(wù)。此外，一些數(shù)量較低的菌種在分離培養(yǎng)過程中會由于優(yōu)勢種群的生存競爭而無法生長[4]，還有一些菌種無法用現(xiàn)有的技術(shù)獲得分離培養(yǎng)[5-7]。因此培養(yǎng)依賴方法的群落分析結(jié)果無法準(zhǔn)確表征實(shí)際的微生物群落，甚至有時會曲解其中的微生物多樣性。

對于群落中的微生物是如何在它們的自然生境中共同生存和生長方面的認(rèn)識還非常有限，而且目前也沒有一種培養(yǎng)基能夠完全模擬微生物群落的生存環(huán)境，因此必須要使用非介入性的非培養(yǎng)方法。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，環(huán)境微生物群落的分析越來越依賴于基于DNA(或RNA)基因序列分析技術(shù)的非培養(yǎng)方法。非培養(yǎng)技術(shù)的根本在于從樣品中直接提取總DNA(或RNA)，再加上后繼的基因指紋圖譜技術(shù)等整體性分析，就能夠克服傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法所帶來的弊端，使人們能夠更加接近環(huán)境中微生物的真實(shí)群落結(jié)構(gòu)和多樣性。這類方法更加快速而準(zhǔn)確，更加適合于分析微生物群落隨時間的演替，使得人們能夠詳盡研究干酪中微生物的群落動力學(xué)。

1 非培養(yǎng)技術(shù)及其在干酪微生物群落分析中的應(yīng)用

非培養(yǎng)技術(shù)是以微生物的核酸(基因組DNA或RNA)序列信息為依據(jù)，通過分析環(huán)境樣品中核酸分子的種類和數(shù)量來反映該群落中微生物的種類和數(shù)量。由于每種微生物細(xì)胞都具有其獨(dú)特的核酸分子，其序列組成也有各自獨(dú)特的特征，因此，通過直接從環(huán)境樣品中提取所有微生物的核酸(基因組總DNA或RNA)，依據(jù)核苷酸序列的不同，分析這些DNA或RNA的種類和相對數(shù)量，就可以反映出微生物的種類組成以及數(shù)量比例情況，從而對微生物的群落結(jié)構(gòu)得到一個比較客觀、全面的認(rèn)識。

1.1 基因克隆文庫分析

不經(jīng)純培養(yǎng)，直接提取環(huán)境樣品中微生物細(xì)胞的總基因組DNA，環(huán)境基因組總DNA是環(huán)境中各種微生物基因組的混合物，通過分析微生物基因組DNA的組成可以反映樣品中微生物種類組成，這是因?yàn)槲⑸锏幕蚪MDNA序列具有種屬特征，可以成為識別和鑒定微生物種屬地位的可靠指標(biāo)。但由于環(huán)境樣品中微生物DNA的組成過于復(fù)雜，不宜直接對這些DNA混合物進(jìn)行序列分析。一般需與特定的PCR方法相結(jié)合，通過對擴(kuò)增得到的帶有進(jìn)化信息或某種功能信息的標(biāo)記基因的組成進(jìn)行分析，而推知整個系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)。理論上，從干酪樣品中提取總DNA，然后通過構(gòu)建克隆文庫對不同的克隆基因片段進(jìn)行測序，就能夠獲得樣品中微生物真實(shí)的群落結(jié)構(gòu)。不過這需要進(jìn)行大規(guī)模的克隆和測序以確保其中所有的物種都被測序，即使克隆測序的成本在逐年下降，但如果作為日?；镜姆治龇椒ㄈ燥@得十分昂貴。在已有的相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]報道中，這種測序的方法僅僅作為一種其他分析技術(shù)的補(bǔ)充手段被應(yīng)用于干酪微生物群落分析。例如Carraro等[11]2010年將傳統(tǒng)培養(yǎng)法、實(shí)時定量PCR分析法與構(gòu)建16S克隆文庫測序法相結(jié)合，測定了Montasio干酪在制作過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替變化。結(jié)果顯示，S. thermophilus是整個Montasio干酪成熟過程中的優(yōu)勢乳酸菌種。同時Pseudomonasspp.和Lactococcus piscium存在于干酪成熟的起始階段。

1.2 DNA指紋圖譜分析

基于基因克隆文庫分析的限制因素，另外一類不需要大規(guī)?？寺y序的分子分析方法得到了廣泛應(yīng)用。即基于凝膠電泳或色譜原理的DNA片斷指紋圖譜分析法。這些方法的基本原理和在干酪微生物群落分析中的應(yīng)用簡介從以下幾個方面來闡述。

1.2.1 PCR-變性梯度凝膠電泳和PCR-時間溫度梯度凝膠電泳

傳統(tǒng)的核酸電泳分離主要是依據(jù)分子的大小和所帶電荷的多寡，當(dāng)待分離核酸的長度相同或相近時，很難達(dá)到分離的目的。而變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)不是基于核酸分子質(zhì)量的不同將DNA片斷分開，而是根據(jù)序列的不同，將片斷大小相同但堿基組成不同的DNA序列分開。當(dāng)雙鏈DNA分子在含梯度分布的變性劑(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時，因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關(guān)，所以具有不同序列的DNA片斷就會滯留于凝膠的不同位置，結(jié)束電泳時，形成相互分開的帶譜。然而一旦雙鏈DNA完全解鏈成單鏈DNA，它們又能在膠中繼續(xù)遷移，從而影響電泳結(jié)果。因此，為了調(diào)節(jié)目的序列的解鏈行為，在PCR擴(kuò)增目的片斷時，需在某一引物的5＇端人為地加上一段約40個富含GC堿基的序列，稱之為“GC帽”或“GC夾子”(GC-clamp)，它的解鏈溫度很高，因此可以防止DNA片斷的完全解鏈，從而提高DNA片斷在DGGE/TGGE膠中的分離效果。理論上認(rèn)為，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、溫度范圍、電泳時間、電壓等足夠精細(xì)，有一個堿基差異的DNA片斷都可被分開。時間溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE)與DGGE原理類似，只是不需化學(xué)變性劑的梯度，用恒定的變性劑濃度制膠，在電泳過程中緩沖液的溫度逐漸升至最高，因此，電泳過程的變性環(huán)境是由凝膠中恒定濃度的變性劑和逐漸升高的電泳溫度共同完成，快速而高效，相比DGGE具有更高的可重復(fù)性。

PCR-DGGE由Fischer等[12]于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明，最初主要用于檢測DNA突變。1993年Muyzer等[13]首次將該技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜微生物群落的研究，此后10年，眾多研究者運(yùn)用變性-溫度梯度凝膠電泳(DGGE-TTGE)技術(shù)進(jìn)行了大量環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究工作，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成了一項(xiàng)主要的微生物分子生態(tài)學(xué)分析方法。PCR-DG/TTGE也是目前在乳制品特別是干酪產(chǎn)品微生物群落研究中應(yīng)用最為廣泛的分子分析技術(shù)[14-16]。PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)勢在于圖譜中的電泳條帶能夠直接從丙烯酰胺凝膠中提取并測序，因此也可以對任何感興趣的條帶進(jìn)行測序，通過與數(shù)據(jù)庫中的已知序列對比獲得更多的信息。

近年來，PCR-DG/TTGE技術(shù)已經(jīng)被成功地用于研究多種手工奶酪中細(xì)菌群落的多樣性、生物活性以及制作工程中的生物動力學(xué)變化。干酪中的復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)由細(xì)菌、酵母和霉菌組成，其中細(xì)菌是奶酪生產(chǎn)過程中的主要的群體，2002年Ogier等[15]用PCR-TTGE技術(shù)對奶酪中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，通過對主要條帶測序分析發(fā)現(xiàn)有Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Enterococcus、Pediococcus、Streptococcus和Staphylococcus屬的成員存在。Randazzo等[17]于2002年使用PCR-DGGE技術(shù)研究了微生物群落在Ragusano干酪生產(chǎn)和成熟過程中的動力學(xué)變化，并對多種不同Ragusano手工干酪中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對比。結(jié)果表明，手工干酪中微生物群落的多樣性較使用商業(yè)化發(fā)酵劑生產(chǎn)的干酪要更加復(fù)雜。同樣的方法也被應(yīng)用于揭示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在Pecorino Siciliano干酪的整個生產(chǎn)過程中的動力學(xué)變化，對Pecorino Siciliano干酪成品的研究表明其中最主要的優(yōu)勢菌群為Streptococcus bovis和L. lactisspecies[18]。2005年Florez等[19]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)對藍(lán)紋干酪Spanish blue-veined Cabrales Cheese)中的微生物群落進(jìn)行了研究，兩種方法的結(jié)果基本一致，不過通過對DGGE圖譜中條帶的測序表明97%的序列來自已知的可培養(yǎng)種群，而另外的3%則為未被培養(yǎng)的種群。2010年Alegria等[20]同樣運(yùn)用PCR-DGGE的方法和傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分別研究了藍(lán)紋干酪中微生物群落在制作和成熟過程中的組成和變化。Streptococcus thermophilus在非培養(yǎng)方法中被檢測到而在培養(yǎng)方法中則未被檢測到。在其他主要微生物的群落結(jié)構(gòu)和演替方面，兩種研究方法的結(jié)果非常接近。這些發(fā)現(xiàn)表明合理運(yùn)用非培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)可以獲得傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所不能得到的信息。PCR-DGGE和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的研究結(jié)果也并非總是非常相似，Kafili等[21]2009年研究伊朗傳統(tǒng)Lighvan干酪的微生物群落結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，雖然PCR-DGGE和培養(yǎng)法的結(jié)果都顯示Lactococcus lactis和Lactobacillusspp.為優(yōu)勢菌，但在研究Lactobacillus屬中具體的優(yōu)勢種時兩種方法的結(jié)果出現(xiàn)了差異。PCR-DGGE顯示Lactobacillus curvatus和Lactobacillus sakei為優(yōu)勢種，而培養(yǎng)法顯示Lactobacillus paraplantarum，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus brevis和Lactobacillus plantarum為可培養(yǎng)的優(yōu)勢種。2010年Alessandria等[22]同樣用PCR-DGGE和培養(yǎng)法研究了Planalto de Bolona干酪中的微生物群落結(jié)構(gòu)，在表征真菌群落時培養(yǎng)方法顯示Candida屬為整個制作過程中的優(yōu)勢真菌，而PCR-DGGE的結(jié)果顯示Aureobasidium pullulans是真菌群落中的優(yōu)勢菌。

1.2.2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR技術(shù)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(single-strand conformation polymorphism，SSCP-PCR)技術(shù)的理論基礎(chǔ)是單鏈DNA具有序列特異性的二級結(jié)構(gòu)，序列組成上的差異(至少1個堿基的差異)也會影響這種二級結(jié)構(gòu)，而這種變化可以通過非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測得到。分析樣品時，雙鏈DNA首先要變性為單鏈后，再上樣電泳分析，不同的DNA單鏈由于其二級結(jié)構(gòu)不同，就會電泳到不同的位置，從而進(jìn)行分離，得到群落結(jié)構(gòu)圖譜。SSCP-PCR技術(shù)本來是用于臨床鑒定基因突變，近年來被應(yīng)用到微生物生態(tài)學(xué)的研究[23-24]。SSCP-PCR技術(shù)相比PCR-DG/TTGE技術(shù)可以同時分析更多的樣品，分析更加容易和快速，因?yàn)樗恍枰獦?gòu)建電泳梯度，也不用添加GC夾子。因此SSCP-PCR技術(shù)更加適合用于分析環(huán)境中微生物群落在不同時間或空間條件下的群落結(jié)構(gòu)演替。

近年來，該技術(shù)被用來分析干酪樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及干酪生產(chǎn)和成熟過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替。如Duthoit等[25]用16S rRNA基因的SSCP對奶酪生產(chǎn)過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)從3個農(nóng)民提供的3份樣品得到的圖譜顯著不同。Saubusse等[26]運(yùn)用SSCP-PCR技術(shù)通過對不同干酪樣品中微生物群落的分析來區(qū)別其中的微生物群落是否具有抑制沙門氏菌生長的功能。結(jié)果表明，通過對16S rRNA基因的V2區(qū)片斷進(jìn)行SSCP分析，能夠?qū)⒂猛N工藝生產(chǎn)的不同干酪樣品區(qū)別開，然后再通過與具有抑制沙門氏菌微生物的分析圖譜進(jìn)行對比，就能判斷出其是否對沙門氏菌具有抑制作用。此外，Callon等[27]運(yùn)用SSCP技術(shù)成功對3種傳統(tǒng)Registered Designation of Origin (R.D.O.) Salers cheeses中的酵母菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的對比表明SSCP分析的結(jié)果非常準(zhǔn)確，證明該技術(shù)可以被用來快速分析干酪樣品在制作過程中的酵母菌群落演替。2009年Mounier等[28]運(yùn)用SSCP-PCR法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法對市售Livarot干酪表面的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。培養(yǎng)法分離出細(xì)菌經(jīng)過SSCP去重復(fù)后進(jìn)行基因測序鑒定，同時從樣品中提取的總DNA運(yùn)用SSCP-PCR法進(jìn)行分析。結(jié)果兩種方法均表明主要的優(yōu)勢細(xì)菌為Microbacterium gubbeenense，Leucobacter komagatae以及Gamma變形菌綱的革蘭氏陰性菌。

1.2.3 末端限制性片段長度多態(tài)性分析

末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析群落結(jié)構(gòu)的一般步驟是：在提取樣品中微生物的總DNA后，先用帶有熒光標(biāo)記的細(xì)菌通用性引物微生物群落的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后選用合適的限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切割。酶切產(chǎn)物最后通過測序凝膠或毛細(xì)管自動測序儀進(jìn)行分離檢測。該方法只能檢測帶有熒光標(biāo)記的酶切片段，因此最后得到的結(jié)果只是PCR產(chǎn)物的末端。不過由于系統(tǒng)分類地位不同的細(xì)菌的16S rRNA基因各自的酶切識別位點(diǎn)不同，它們各自帶有熒光的末端片段長短也不同，因此能夠在測序膠中就能被分辨開。同時，熒光的強(qiáng)度還能反映出各微生物種群在整個群落中的分布比例。

T-RFLP是近幾年來剛發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，它既可以用來鑒定菌株，也可以對比分析不同的群落結(jié)構(gòu)，還可以評估特定群落中系統(tǒng)進(jìn)化類群的細(xì)菌多樣性。Liu等[29]最先使用T-RFLP方法來分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以區(qū)分一個典型的細(xì)菌群落中所有的成員，圖譜與預(yù)測的完全一致。T-RFLP技術(shù)成功地區(qū)分了白蟻后腸、水體沉積物、兩個不同的活性污泥等環(huán)境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，證明了該技術(shù)可以快速比較微生物群落結(jié)構(gòu)的差異及分析不同生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性。Rademaker等[30]于2005年運(yùn)用T-RFLP技術(shù)分析了微生物群落結(jié)構(gòu)在干酪的成熟過程中的動力學(xué)變化。該實(shí)驗(yàn)的研究對象為3種不同的Tilsit表面涂抹成熟干酪，在這些干酪成熟的8周當(dāng)中，運(yùn)用T-RFLP技術(shù)對干酪表面的微生物群落組成進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，涂抹發(fā)酵劑中的菌種存在于整個成熟過程中，而來自環(huán)境中的微生物數(shù)量多數(shù)在2～4周后達(dá)到最大，而后又迅速降低，甚至于8周后無法檢測到。不過Corynebacterium屬是個例外，在干酪完全成熟后仍然是其表面的優(yōu)勢菌。Arteau等[31]2010年運(yùn)用T-RFLP法對Camembert干酪中的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。分析結(jié)果表明干酪表面與內(nèi)部、不同批次干酪、不同生產(chǎn)工藝以及不同成熟時間制得的干酪中真菌的群落結(jié)構(gòu)都有所不同。研究中共檢測和鑒定出了以下9種真菌：Cladosporium、Debaryomyces、Geotrichum、Kluyveromyces、Mucor、Penicillium、Pichia、Saccharomyces以及Yarrowia。

1.2.4 變性高效液相色譜技術(shù)

變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技術(shù)采用高壓閉合液相流路, 利用離子對反相液相色譜技術(shù)進(jìn)行核酸片段的分離和分析。采用的離子對為三乙基胺醋酸鹽緩沖溶液(TEAA)，它既是疏水的又帶正電荷，既能與DNA片段分子上帶負(fù)電荷的磷酸根基團(tuán)反應(yīng)，同時疏水基團(tuán)又能與固定相C18鏈的疏水基團(tuán)發(fā)生疏水作用力而相互吸引。TEAA由此作為“橋分子”將DNA分子片斷吸附在固定相上面。當(dāng)用流動相對色譜柱進(jìn)行洗脫時，與固定相親和力不同的DNA分子就能相互區(qū)分開來。DHPLC最初被設(shè)計用來臨床上檢測單核苷酸多肽性[32]，由于異源雙鏈DNA分子更加容易部分解鏈成單鏈而與固定相的親和力下降，更早的被流動相洗脫，從而達(dá)到分離的目的。

DHPLC技術(shù)在分析微生物群落結(jié)構(gòu)方面有著美好的發(fā)展前景。根據(jù)Barlaan等[33]的描述，在特定變性條件和適當(dāng)洗脫緩沖液的濃度梯度條件下，大小相同但堿基序列不同的DNA分子由于具有不同的解鏈特性，會有不同的洗脫時間，因此能夠得以相互分離。DHPLC具有通量高、自動化的特點(diǎn)，并且洗脫出來的PCR擴(kuò)增片斷收集后可直接用于測序，與PCR-DG/TTGE等方法相比更加方便快捷。目前該方法已經(jīng)成功用于分析海水微生物群落和監(jiān)測腸道微生物菌群。此外Ercolini等[34]于2008年第一次將DHPLC技術(shù)用于分析食品相關(guān)樣品中的微生物多樣性。采用了DHPLC和DGGE兩種方法分析了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的天然乳清發(fā)酵劑(natural whey cultures，NWC)中的細(xì)菌多樣性。對兩種方法研究結(jié)果的比較后證明DHPLC技術(shù)在研究食品微生物群落多樣性方面至少和DGGE同樣有效。在此之后，Mounier等[35]2010年成功運(yùn)用DHPLC技術(shù)分析鑒定了Red Smear干酪表面的酵母菌組成。

2 非培養(yǎng)方法的局限性和缺陷

任何分析方法都有一定的局限性，非培養(yǎng)方法雖然能夠避免傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，但其自身也有一定的缺陷。本綜述所提及的大多數(shù)非培養(yǎng)方法都基于DNA序列分析的分子生物學(xué)技術(shù)，而分子生物學(xué)方法在分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時的局限性在于：首先在提取干酪樣品中總DNA前的樣品處理過程很容易改變微生物群落的原始結(jié)構(gòu)，而不同微生物在提取DNA時的裂解效率不同也會使得DNA的提取和純化產(chǎn)生一定的偏差。其次，PCR技術(shù)本身也存在不足，1992年Reysenbach等[36]發(fā)現(xiàn)用rDNA基因在PCR過程中會產(chǎn)生優(yōu)先擴(kuò)增現(xiàn)象，只擴(kuò)增部分細(xì)菌的D NA，造成了群落中原始成員的減少。而干酪樣品成分復(fù)雜，提取DNA時所殘留的雜質(zhì)很可能會成為PCR擴(kuò)增抑制劑，影響PCR效果[37-38]。

此外，目前用于分析干酪樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的非培養(yǎng)方法，如PCR-DG/TTGE、SSCP-PCR、T-RFLP、DHPLC甚至是生物芯片技術(shù)都有可能造成共遷移或共洗脫現(xiàn)象[8-10,13-14]。不過由于允許對電泳條帶或洗脫物中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，DGGE、DHPLC等技術(shù)更容易克服這種缺陷。與共遷移現(xiàn)象相反，DNA指紋圖譜技術(shù)的另一個普遍問題在于占微生物群落1%以下的弱勢種群很難被檢測到，微弱的電泳條帶或洗脫峰很難與背景噪音區(qū)別開來[8]。盡管如此，非培養(yǎng)方法已經(jīng)被證明為監(jiān)測干酪生產(chǎn)和成熟過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替的有效手段。

3 非培養(yǎng)技術(shù)在干酪微生物群落分析中的應(yīng)用前景

非培養(yǎng)技術(shù)是一門剛剛興起的微生物群落結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，近年來受到科學(xué)家的青睞取得了令人矚目的成就，不過這些技術(shù)仍然處于發(fā)展階段，特別是在食品領(lǐng)域還處于起步階段。無論是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法還是基于分子生物學(xué)技術(shù)的非培養(yǎng)法，都是試圖揭示環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的一種途徑。本文中提及的非培養(yǎng)方法都是近年來在研究干酪為生物群落結(jié)構(gòu)中應(yīng)用較為廣泛的方法，在近年來的研究中已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的優(yōu)越性，成為研究干酪以及其他食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的有效工具。不過每種方法都有自身的優(yōu)勢和不足。為了利用各種分析方法的優(yōu)勢，彌補(bǔ)它們技術(shù)本身的缺陷，將不同分析方法結(jié)合起來進(jìn)行研究近年來已經(jīng)成為了一種新的趨勢。例如2008年Ercolini等[34]將PCR-DGGE、DHPLC和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR(RAPD-PCR)這3種方法結(jié)合研究了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的乳清發(fā)酵劑中的微生物群落結(jié)構(gòu)。2010年Arteau等[31]將T-RFLP法和自動核糖體間隔基因分析(automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)法相結(jié)合對Camembert干酪中的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。此外，克隆文庫法已經(jīng)被廣泛地與其他方法相結(jié)合，成為干酪中微生物群落結(jié)構(gòu)的有效途徑。

本文提及的大部分非培養(yǎng)法都是基于PCR擴(kuò)增的方法，必然會帶有PCR擴(kuò)增自身的缺陷。這些方法之間的不同組合也無法彌補(bǔ)PCR擴(kuò)增本身帶來的不足。因此基于其他原理的分析技術(shù)需要被引入以加強(qiáng)對環(huán)境中微生物群落真實(shí)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性信息，可以在自然環(huán)境中監(jiān)測和鑒定不同的微生物個體，提供微生物的形態(tài)學(xué)、數(shù)量信息、空間分布、細(xì)胞環(huán)境等信息，整個分析過程對樣品的介入性很小，可以彌補(bǔ)PCR擴(kuò)增所帶來的偏差。將FISH和其他分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合使人們能夠得到更接近真實(shí)情況的微生物群落分布信息。2009年Mounier等[28]首次對此做出了嘗試，用3種方法系統(tǒng)地對市售的Livarot干酪表面微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。首先用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對市售的細(xì)菌和真菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，分離所得菌株通過SSCP分析去重復(fù)后進(jìn)行16S rRNA基因測序鑒定，再用SSCP-PCR分析法對從干酪樣品分離的總DNA進(jìn)行分析，最后FISH分析法被用來對干酪表面的微生物進(jìn)行綱水平的多樣性分析。FISH分析法中使用的特異性探針能夠直接對干酪中的微生物進(jìn)行檢測，從而提供了微生物群落多樣性的最直接證據(jù)?；趓RNA的分子方法與FISH分析法的結(jié)合被證實(shí)是一種研究干酪表面微生物群落的有效手段。

數(shù)10年來人們一直致力于對干酪樣品以及整個生產(chǎn)和成熟過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，從傳統(tǒng)培養(yǎng)法到分子生物學(xué)技術(shù)，其目的不僅僅是獲得微生物群落的分布信息，更重要的是將這些信息與微生物的功能聯(lián)系起來，從而能夠?qū)Ω衫耶a(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)起到指導(dǎo)性作用。非培養(yǎng)方法雖然可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，利用不同分子生物學(xué)技術(shù)可以獲得更加真實(shí)的微生物群落多樣性，不過這并不意味著可以摒棄培養(yǎng)方法。非培養(yǎng)方法可以快速得到群落的整體結(jié)構(gòu)情況，而要得到系統(tǒng)中在功能上起重要作用的菌群則需要傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。因此，單憑傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法或現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)對干酪或其他生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究，都不能很好地達(dá)到研究目的。已經(jīng)有眾多研究者認(rèn)識到了將多種方法結(jié)合使用的重要性，本文已經(jīng)多次提及這樣的例子，在此不再贅述[11,20-21,28]。用分子技術(shù)指導(dǎo)分離培養(yǎng)的方向，用分離培養(yǎng)的結(jié)果對分子方法進(jìn)行驗(yàn)證，二者互為補(bǔ)充，已經(jīng)成為研究干酪以及其他食品中微生物生態(tài)學(xué)的新方向。

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Application of Culture-independent Methods for Analyzing Microbial Communities in Cheese: A Review

MO Bei-hong，SUN Li-guo
(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co. Ltd., Shanghai 200436, China)

The application of culture-independent methods in food industry is still in the preliminary stage. In this paper, the application of the most common culture-independent approaches for describing both bacterial and fungal communities in cheese and for monitoring microbial community in cheese manufacturing and ripening process has been reviewed. The most commonly used DNA fingerprinting techniques for investigating microbial communities in cheese are introduced, which include PCRDGGE, PCR-TTGE, SSCP-PCR, DHPLC and other techniques. Furthermore, the benefits, pitfalls and perspectives of cultureindependent methods in cheese are discussed. Based on the discussion, a polyphasic approach with the combination of culturedependent and culture-independent methods may be the best strategy to achieve more accurate structures of microbial communities.

culture-independent methods；cheese；DNA fingerprinting techniques；microbial communities

TS252.53

A

1002-6630(2012)05-0293-06

2011-04-06

上海市科委啟明星項(xiàng)目(09QB1400200)

莫蓓紅(1978—)，女，工程師，碩士研究生，主要從事乳品發(fā)酵技術(shù)與新型干酪的研究與開發(fā)。E-mail：mobeihong@brightdairy.com