吳文新，劉惠民，崔愛榮，崔晉峰，張杰英，張祥宏

在大腸癌的“腺瘤－癌演進(jìn)學(xué)說”中，細(xì)胞增殖與凋亡失衡是大腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。Livin作為新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，其異常高表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增生并向惡性轉(zhuǎn)化［1－2］。Caspase－3是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，它通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，關(guān)于Livin和Caspase－3在腫瘤中表達(dá)的研究國內(nèi)外已有報(bào)道［3－4］，但Livin與Caspase－3在散發(fā)性大腸管狀腺瘤癌變過程中的可能作用少有報(bào)道。本研究采用免疫組化法檢測了118例散發(fā)性大腸管狀腺瘤伴上皮不同程度異型增生及癌變組織中Livin和Caspase－3的表達(dá)情況，并研究兩者的關(guān)系，以探討Livin和Caspase－3在大腸管狀腺瘤癌變中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院病理科2004年12月—2009年12月切除的散發(fā)性大腸管狀腺瘤存檔蠟塊，由兩位高年資病理醫(yī)師對全部切片進(jìn)行復(fù)診。診斷為大腸管狀腺瘤及癌變的組織118例，其中大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生及癌變病例分別為30、33、26和29例。同時(shí)選取25例正常大腸黏膜作對照。

1.2 免疫組化染色方法 采用免疫組化SP法對所有組織進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)按照說明書操作，兔抗人Livin多克隆抗體為Nanspec公司產(chǎn)品，稀釋濃度為1∶150，兔抗人Caspase－3多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，稀釋濃度為1∶100，以磷酸鹽緩沖液 (PBS)替代一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 Livin和Caspase－3陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合計(jì)分。即隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，陽性細(xì)胞百分比＜5%、5% ～35%、36% ～70%和＞70%時(shí)分別計(jì)為0、1、2、3分;染色強(qiáng)度以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色計(jì)分，陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度為無色、淡棕色、棕黃色和棕褐色時(shí)分別計(jì)為0、1、2、3分;將陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度兩者的計(jì)分相加，0～1分為陰性 (－)，≥2分為陽性 (+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin表達(dá)情況 Livin陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。正常大腸黏膜組、大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組的Livin陽性表達(dá)率分別為16.0% (4/25)、57.3% (51/89)和86.2%(25/29)，3組的Livin陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=27.027，p＜0.05，見圖1、圖2)。大腸管狀腺瘤伴異型增生組和癌變組的Livin陽性表達(dá)率均明顯高于正常大腸黏膜組 (χ2值分別13.335和26.617，p＜0.05)，癌變組的Livin陽性表達(dá)率亦高于大腸管狀腺瘤伴異型增生組 (χ2=7.971，p＜0.05)。大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生組Livin陽性表達(dá)率分別為50.0%(15/30)、54.5%(18/33)和69.2%(18/26)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=2.268，P＞0.05)。

2.2 Caspase－3表達(dá)情況 Caspase－3陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。正常大腸黏膜組、大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組的Caspase－3陽性表達(dá)率分別為76.0% (19/25)、40.4%(36/89)和10.3% (3/29)，3組的Caspase－3陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=24.006，p＜0.05，見圖3、圖4)。大腸管狀腺瘤伴異型增生組和癌變組的Caspase－3陽性表達(dá)率均明顯低于正常大腸黏膜組 (χ2值分別為9.879和23.972，p＜0.05)，且Caspase－3在癌變組的表達(dá)明顯低于在大腸管狀腺瘤伴異型增生組的表達(dá) (χ2=8.959，p＜0.05);大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生組Caspase－3陽性表達(dá)率分別為66.7% (20/30)、39.4% (13/33)和11.5% (3/26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=17.598，p＜0.05)。

2.3 Livin和Caspase－3表達(dá)的關(guān)系 Livin和Caspase－3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (r=－0.305，p＜0.05，見表1)。

表1 大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組Livin和Caspase－3表達(dá)的關(guān)系Table 1 Correlation between the expression of Livin and Caspase－3 in colorectal tubular adenoma and with different dysplasia and with cancerous changes

圖1 大腸管狀腺瘤伴上皮異型增生，Livin在細(xì)胞質(zhì)呈陽性表達(dá)(SP，×200)Figure 1 Positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with mild dysplasia

圖2 大腸管狀腺瘤癌變，Livin在細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性表達(dá)(SP，×100)Figure 2 Strong positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

圖3 大腸管狀腺瘤伴上皮異型增生，Caspase－3在細(xì)胞質(zhì)呈陽性表達(dá) (SP， ×100)Figure 3 Positive expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with dysplasia

圖4 大腸管狀腺瘤癌變，Caspase－3在細(xì)胞質(zhì)呈陰性表達(dá) (SP，×100)Figure 4 Negative expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

3 討論

大腸管狀腺瘤被認(rèn)為是大腸癌主要的癌前病變［5］，目前研究表明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡基因及抑制細(xì)胞凋亡基因相互調(diào)控作用密切相關(guān)。

Livin是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)成員之一，因其特異性高表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)［6］。已有研究表明，Livin在大腸癌中表達(dá)增高并發(fā)揮其相應(yīng)的作用［7］，但有關(guān)Livin在散發(fā)性大腸管狀腺瘤癌變過程中的表達(dá)報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，Livin隨異型增生程度的增高及癌變的出現(xiàn)，其陽性表達(dá)率逐漸增高，且明顯高于正常大腸黏膜組，提示Livin表達(dá)上調(diào)可能是細(xì)胞逃離凋亡監(jiān)視機(jī)制，造成異常的增殖，并使異常分化的細(xì)胞不斷積累，由此推進(jìn)病程進(jìn)展，并向惡性轉(zhuǎn)化，促使大腸管狀腺瘤發(fā)生癌變，說明Livin的異常表達(dá)與大腸管狀腺瘤癌變關(guān)系密切，可能參與了大腸管狀腺瘤癌變的發(fā)生。

研究顯示，Livin抑制細(xì)胞凋亡作用途徑主要與Caspase家族相互作用，而Caspase－3是Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者［8］。Livin主要通過其 BIR區(qū)與半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)結(jié)合，抑制其活性，阻止Caspase－3蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能，達(dá)到阻斷凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，在大腸管狀腺瘤癌變過程中，隨異型增生程度的增高及癌變的出現(xiàn)，Caspase－3的表達(dá)呈遞減趨勢，說明Caspase－3能促進(jìn)細(xì)胞正常死亡，抑制癌的發(fā)生，提示Caspase－3可能在大腸管狀腺瘤癌變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外，Livin與Caspase－3在大腸管狀腺瘤癌變中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Caspase－3蛋白在腺瘤癌變過程中被Livin抑制而表達(dá)降低，提示二者可能共同參與了大腸管狀腺瘤癌變的發(fā)生過程，這證實(shí)Livin對誘發(fā)凋亡的效應(yīng)性蛋白酶Caspase－3可能有直接抑制作用［8］。

總之，Livin不僅參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，還促進(jìn)了細(xì)胞增殖，Livin可能下調(diào)Caspase－3的表達(dá)，共同促進(jìn)大腸管狀腺瘤癌變的發(fā)生，Livin有望成為結(jié)直腸癌靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。本課題組對大腸管狀腺瘤癌變中細(xì)胞凋亡基因及抑制細(xì)胞凋亡基因間的相互調(diào)控作用有待進(jìn)一步深入研究。

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