王剛　劉毅

組織工程的核心是建立由種子細(xì)胞和生物材料支架構(gòu)成的三維空間結(jié)構(gòu)復(fù)合體，生物材料是組織工程發(fā)展的關(guān)鍵，隨著材料科學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，各種適合細(xì)胞生長、繁殖和分化的天然和合成的可降解材料被用來制作組織工程支架。要成功構(gòu)建工程化的脂肪組織，選擇適當(dāng)?shù)闹Ъ懿牧鲜潜夭豢缮俚?。支架材料為種子細(xì)胞提供貼服場所，而且決定最終構(gòu)建的脂肪組織形狀，因此，支架材料的理化特性是需要考慮的非常重要的因素。本文就脂肪組織工程支架材料的研究進(jìn)展做一綜述。

1 概述

脂肪組織工程旨在把獲得的種子細(xì)胞種植在三維結(jié)構(gòu)支架材料上，在合適的微環(huán)境及細(xì)胞因子的作用下，發(fā)育為成熟的脂肪組織。支架材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)，為種子細(xì)胞提供了適合其遷移、粘附、生長、繁殖的生物學(xué)空間，促進(jìn)合成新的細(xì)胞外基質(zhì)成分，支持新陳代謝 [1]。前脂肪細(xì)胞只有貼附于合適的支架上，才能進(jìn)行分化、增殖。支架材料和人體組織直接接觸，所以對其生物學(xué)特性和理化性質(zhì)有較高的要求。理想的用于脂肪組織工程的支架材料應(yīng)具備的條件為：①足夠的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性；②良好的生物相容性；③生物活性和生物降解性；④具有適合的三維空間多孔結(jié)構(gòu)；⑤能提供明確的生物學(xué)上的刺激因素，促進(jìn)血管形成；⑥具有可加工性、可消毒性及抗凝血性；⑦來源充足，易于重復(fù)制作、加工成型。

2 支架材料來源

目前，用于構(gòu)建脂肪組織工程的支架材料包括天然和人工合成材料。常用的天然高分子生物材料主要分為多糖類和蛋白質(zhì)類兩大類，包括殼聚糖、藻朊酸鹽、膠原蛋白、絲素蛋白、透明質(zhì)酸及其衍生物等，這類材料自身包含的生物信息能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生或維持各種功能，所含的一些天然結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的附著或保持分化，而且它們具有良好的生物相容性和化學(xué)多樣性，可以促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，降解過程受細(xì)胞控制[2]。但這類材料在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，會出現(xiàn)質(zhì)量難以控制、性能變化與結(jié)構(gòu)變化不成比例等，而且來源有限，價格較為昂貴，使其應(yīng)用受到一定程度限制[3]。在臨床應(yīng)用中，為了盡可能降低機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性，確保支架長期穩(wěn)定，天然材料通常要在應(yīng)用前進(jìn)行一些預(yù)處理。人工合成材料包括PGA，PLA，PLGA，PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）等，機(jī)械性能良好，設(shè)計制造過程中能對材料的許多性能進(jìn)行控制，易加工成不同的形狀，可以被制作成凝膠、海綿、纖維網(wǎng)織物和納米纖維[4]，被廣泛用作生物材料。

3構(gòu)建組織工程脂肪支架材料

3.1 膠原蛋白：膠原蛋白是一種由三條肽鏈組成的纖維狀蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織中，是目前組織工程研究中最常用的天然生物材料。膠原蛋白有著良好的機(jī)械性能及生物相容性，可被膠原蛋白酶和基質(zhì)金屬酶生物降解[5]，免疫原性較低，細(xì)胞對其適應(yīng)性強(qiáng)，可承載多種細(xì)胞，具有三維多孔結(jié)構(gòu)，能釋放生物活性因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)脂肪組織形成，可塑性良好，制備方便，是一種較理想的脂肪組織工程支架材料。膠原蛋白以I、Ⅱ、Ⅲ型最為多見，其中I型膠原由于性能優(yōu)良且含量豐富，已被廣泛用于構(gòu)建組織工程人工皮膚。I型膠原凝膠支架具有半固體、半液態(tài)的特點(diǎn)，能夠相對容易地實現(xiàn)細(xì)胞的均勻分布，而且能夠通過物理性捕獲效應(yīng)將大量細(xì)胞限制于其中，同時解決了細(xì)胞與材料的復(fù)合問題及接種過程中細(xì)胞的丟失問題 [6]。Ⅰ型膠原海綿孔隙率較高，具有較大的空間和比表面積，可以為脂肪干細(xì)胞的生長和增殖提供更為廣闊的空間，孔徑較適合細(xì)胞粘附生長，對脂肪干細(xì)胞的吸附率較高。將人成纖維細(xì)胞接種在天然膠原蛋白材料上，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以在膠原海綿支架周圍粘附、生長、增殖分化，隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞長入孔隙內(nèi)，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞連接成片，表明這種材料對細(xì)胞有粘附作用[7]。大量研究表明膠原海綿可以支持多種細(xì)胞來源的脂肪組織生成[8]，將人及兔脂肪干細(xì)胞在Ⅰ型膠原蛋白支架上進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示脂肪干細(xì)胞在支架上粘附、生長和增殖良好，表明I型膠原蛋白支架材料具有良好的細(xì)胞相容性和親和力，有促進(jìn)細(xì)胞粘附和誘導(dǎo)生長分化的作用。細(xì)胞-膠原蛋白復(fù)合物能形成有效的微環(huán)境網(wǎng)，提供豐富的血供，有利于新的脂肪組織的持續(xù)生成[9]。在體內(nèi)，膠原蛋白能促進(jìn)多數(shù)細(xì)胞生長、分化、增殖和代謝，支持粘附種植更多的細(xì)胞，積聚更大量的脂質(zhì)。在膠原凝膠中添加短膠原纖維可以增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)胞的生存力和脂肪積聚。含有封裝了成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2）明膠微球的膠原凝膠被證明在體內(nèi)可以促進(jìn)血管化的脂肪組織發(fā)育[10]。

在應(yīng)用中，膠原蛋白降解產(chǎn)物可被細(xì)胞利用合成新的基質(zhì)，不影響內(nèi)環(huán)境pH 值，而且可參與組織修復(fù)。另一方面，膠原蛋白降解速度過快——在體內(nèi)4周后已完全降解，目前，解決這一問題的主要方法是通過干熱、戊二醛或紫外輻照等方法交聯(lián)，可以在調(diào)節(jié)降解速度的同時，提高其綜合使用性能。此外，膠原蛋白價格較高。膠原材料由于獨(dú)特的生物學(xué)特性，在燒傷、創(chuàng)傷、美容等領(lǐng)域研究中已取得了可喜成果，但作為組織工程載體材料的研究還處于起步階段。

3.2 絲素蛋白：絲素蛋白來源于天然蠶絲或蛛絲，是一種無生理活性的天然結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)上含有疏水區(qū)和親水區(qū)，疏水區(qū)為高度保守的重復(fù)序列，親水區(qū)由更復(fù)雜的序列構(gòu)成[11]。絲素蛋白具有無可比擬的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，力學(xué)性能較其他天然纖維更為優(yōu)良；可被蛋白酶水解，降解速度緩慢，降解產(chǎn)物對周圍組織有營養(yǎng)和修復(fù)作用；生物相容性優(yōu)于傳統(tǒng)的人工合成材料，可以支持細(xì)胞粘附、分化和組織形成[12]；免疫原性低，具有良好的透氣性和透濕性，還能耐受較大范圍的濕度和溫度變化?？蓮V泛應(yīng)用于臨床。在組織工程中，絲素蛋白已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織構(gòu)建的支架材料。絲素蛋白三維多孔性支架材料能夠支持干細(xì)胞的粘附、增殖以及在體內(nèi)的分化。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)接種于絲素蛋白支架上的前脂肪細(xì)胞貼壁良好，生長增殖活躍，兩周左右支架網(wǎng)眼充滿前脂肪細(xì)胞，掃描電鏡可見基質(zhì)分泌。實驗表明絲素蛋白對前脂肪細(xì)胞具有良好的吸附作用，并能維持前脂肪細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。絲素蛋白用做支架材料時，無需再加工。此外，蠶絲來源豐富，價格便宜，處理簡單，可以加工成多種形式的支架，并可通過遺傳工程對其進(jìn)行針對性改造以調(diào)節(jié)降解周期。對于組織工程應(yīng)用，絲素蛋白已經(jīng)被證明是一種多用途的生物材料，在構(gòu)建工程化的脂肪組織中，可以成為前脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的良好天然支架。

3.3 透明質(zhì)酸：透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）為大分子多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并在多種生理活動中起重要作用，例如組織水化作用，營養(yǎng)物擴(kuò)散和細(xì)胞分化等[13]。HA可以特異性地結(jié)合內(nèi)源性受體，如CD44，RHAMM，ICAM-1，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，生長和粘附，從而參與組織生長和改造。研究表明，人類前脂肪細(xì)胞可以成功地在HA基礎(chǔ)支架上接種和培養(yǎng)。此外，接種于這種支架上的人脂肪母細(xì)胞在體內(nèi)能充分分化成熟為脂肪細(xì)胞。由于結(jié)構(gòu)疏松，含水及多孔性因而特別適于細(xì)胞的遷移及增殖，防止細(xì)胞在遷移到位及增殖夠數(shù)之前過早地進(jìn)行分化 [3]。然而，高度親水性導(dǎo)致了力學(xué)特性不佳，加之加工處理特性較差，嚴(yán)重制約了HA應(yīng)用于組織工程學(xué)。為了規(guī)避這些缺陷，在保留HA生物活性的前提下，可以通過交聯(lián)或偶聯(lián)反應(yīng)，對HA進(jìn)行化學(xué)修飾，主要是針對部分葡醣醛酸的羧基的酯化修飾，從而可以獲得一系列的衍生物（HYAFF）。不同的酯化程度可能引起不同的疏水度，孔隙尺寸的不同可能導(dǎo)致細(xì)胞粘附的差異性。其中，HA苯甲基酯（HYAFF R 11）是一種近年來發(fā)展的半合成的可吸收材料，通過酯化修飾，增強(qiáng)了疏水性，延長了在機(jī)體內(nèi)的存在時間，可以更好地抵抗透明質(zhì)酸酶的作用。通過裸鼠模型業(yè)已證實，HYAFF R11海綿-人前脂肪細(xì)胞復(fù)合體在脂肪組織再生中非常有效，把人前脂肪細(xì)胞-HYAFF R 11復(fù)合體移植于裸鼠體內(nèi)3周后，細(xì)胞密度高于膠原復(fù)合體[14]。HYAFF有良好的生物降解速度，作為一種聚多糖，抗原性非常弱。體內(nèi)外實驗已經(jīng)證實其對脂肪母細(xì)胞的增殖、分化有支持作用，且孔徑為400μm的HYAFF支架最合適脂肪母細(xì)胞增殖分化。由于它良好的可加工性和生物相容性，已經(jīng)被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。HA衍生材料三維多孔支架在脂肪組織工程研究中具有廣闊的前景。

3.4 脂肪族聚酯材料：聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為人工合成的脂肪族聚酯材料，具有良好的組織相容性、生物降解性及組織可吸收性，表面活性良好，是常用的細(xì)胞支架材料，被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。PLA、PGA主要用于脂肪組織工程的三維網(wǎng)織物、支架和（或）移植物 [15]。細(xì)胞種植于PGA支架上，可以容易地積聚脂質(zhì)。PLA在體內(nèi)首先降解為乳酸，最終生成二氧化碳和水。PGA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與PLA類似，但降解較快，降解產(chǎn)物-羥基乙酸可以通過三羧酸循環(huán)或以尿液等形式排出體外。PGA通過熔融紡絲可以獲得高強(qiáng)度的PGA纖維，編織后可以得到用于組織工程的多孔支架。PGA纖維具有較高的強(qiáng)度和模量，但是較脆，可以通過與其他分子共聚的方法降低其脆性。目前主要將PGA 與PLA 聚合，或者用羥基乙酸和乳酸的單體共聚形成聚合物PLGA。有時也用膠原溶脹液進(jìn)行包衣處理，以提高PLA 或PGA 作為支架時對細(xì)胞的粘附水平。LA和GA共聚后可以得到PLGA， LA和GA的比例不同，聚合物的降解速率不同。近年來發(fā)現(xiàn)PLGA多孔支架具有介導(dǎo)脂肪組織生成的能力。Patrick等[16]從SD或Lewis大鼠附睪脂肪墊中分離出前脂肪細(xì)胞，在PLGA支架上培養(yǎng)后，移植入大鼠背部，5周后可見分化的脂肪細(xì)胞。源于人和鼠的脂肪細(xì)胞，加入諸如bFGF等因子后種植在PLGA支架上，已經(jīng)被證明可誘導(dǎo)血管形成。李春明等[17]將兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種在PLGA支架上，移植于兔背部肩胛骨兩側(cè)皮下，可見細(xì)胞逐漸擴(kuò)展至支架孔隙中，隨著支架的降解，新的脂肪組織形成明顯，伴有少量的血管長入。前述體內(nèi)外的研究表明PLGA支架能促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖和分化，可作為構(gòu)建工程化脂肪組織的支架材料。PLA體內(nèi)降解需要12周時間，PGA體內(nèi)降解需要4周時間?？梢酝ㄟ^改變其分子量、結(jié)晶度、乳酸和羥基乙酸的比例來控制其降解性，降解速度可以從幾周到幾年不等。降解后的酸性產(chǎn)物降低了局部的pH值，會影響組織和細(xì)胞的粘附和生長，或?qū)е录?xì)胞中毒甚至死亡。而且此類材料太過脆硬，使得患者甚感不適，其來源主要靠進(jìn)口，價格昂貴。目前僅有PLGA等少數(shù)幾種此類材料被SFDA、FDA批準(zhǔn)上市。

4其他支架材料

近年來，可承載脂肪干細(xì)胞的注射凝膠在脂肪組織工程中的前景引起了人們的高度關(guān)注[13]。對于脂肪組織工程的實際應(yīng)用來說，挑戰(zhàn)在于輸送必需的脂肪形成因子，如：胰島素、胰島素樣生長因子、地塞米松等來誘導(dǎo)脂肪形成，藻朊酸鹽已被用作可注射的細(xì)胞載體[5]，這類材料可以按期望的外形進(jìn)行填充，在相關(guān)生長因子的作用下可以增殖，移植時不需開放式外科手術(shù)[18]。纖維結(jié)合素是一種有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，生物相容性良好，通過與整合素相互作用在細(xì)胞識別與細(xì)胞吸附中發(fā)揮效應(yīng)，并且通過影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移增加血管形成，使脂肪生成增加。但還沒有被用來制作三維結(jié)構(gòu)支架。其他已經(jīng)被開發(fā)用于脂肪組織工程的人工合成材料，包括聚乙二醇（PEG）凝膠三維結(jié)構(gòu)支架[19]、聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯組成的網(wǎng)織物[15]等也初顯應(yīng)用前景。明膠海綿材料可生物降解，植入皮下后可被充分吸收，在脂肪組織工程中也展現(xiàn)出光明的前景。

5展望

近年來，由于納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料也日益廣泛應(yīng)用于組織工程。由于脂肪組織對缺血、缺氧極其敏感，而一些細(xì)胞因子，如：VEGF，HGF等對移植物血管形成和血管新生有重要的始動和促進(jìn)作用，把細(xì)胞因子包被在材料里，隨著材料的降解，漸進(jìn)式的釋放，可以促進(jìn)移植物的存活。因此，設(shè)想可以在三維支架上復(fù)合已包被了生長因子的納米生物材料微珠。還可以對生物材料的表面進(jìn)行化學(xué)修飾，支架材料亦可用細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行包被，可以在多聚物支架表面摻入細(xì)胞粘附分子，使之更利于細(xì)胞粘附，增加其生物相容性?？傊?，臨床上脂肪移植的需求與日俱增，加之材料科學(xué)的飛躍發(fā)展，會有更多、性能更卓越的生物材料用于脂肪組織工程。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Brehmer B，Rohrmann D，Becker C，et al. Different types of scaffolds for reconstruction of the urinary tract by tissue engineering[J].Urol Int，2007，78（1）：23-29.

[2]Lee KY，Mooney DJ.Hydrogels for tissue engineering [J].Chem Rev，2001，101（7）：1869-1879.

[3]竺亞斌，高長有，王登勇.聚合物組織工程材料[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2003，20（2）：356-360.

[4]L'ubos D，Ivan V，Radoslav Z.The tissue engineering of articular cartilage： cells， scaffolds and stimulating factors [J].Exper Biol Med，2012，237（1）：10-17.

[5]Hazel T，Edward N，Joshua C.Adipose-Derived Stem Cells： Characterization and Current Application in Orthopaedic Tissue Repair [J].Exper BiolMed，2009，234（1）：1-9.

[6]郝偉，胡蘊(yùn)玉，姜明，等.基于脂肪干細(xì)胞I型膠原凝膠PLGA-B-TCP支架的新型仿生骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建及生物學(xué)性能[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（7）：584-587.

[7]Middelkoop E，Vries HJ，Ruuls L，et al. Adherence， proliferation and collagen turnover by human fibroblasts seeded into different types of collagen sponges [J].Cell Tissue Res，1995，280（2）：447-453.

[8]Neuss S，Stainforth R，Salber J，et al.Long-term survival and bipotent terminal differentiation of human mesenchymal stem cells （hMSC） in combination with a commercially available three-dimensional collagen scaffold [J].Cell Transplant，2008，17（8）：977-986.

[9]Borges J，Mueller MC，Padron NT，et al. Engineered adipose tissue supplied by functional microvessels [J].Tissue Eng，2003，9（6）：1263-1270.

[10]Vashi A，Abberton K，Thomas G，et al.Adipose tissue engineering based on the controlled release of fibroblast growth factor-2 in a collagen matrix[J]. Tissue Engineering，2006，12（11）：3035-3043.

[11]Bini E，Knight D，Kaplan D.Mapping domain structures in silks from insects and spiders related to protein assembly [J].JMoleculBiol，2004，335（1）：27-40.

[12]Saitow C，Kaplan D，Castellot J.Heparin stimulates elastogenesis： Application to silk-based vascular grafts [J].Matrix Biology， 2011，30（5-6）：346-355.

[13]Tan H，Ramirez C，Miljkovic N，et al.Thermosensitive injectable hyaluronic acid hydrogel for adipose tissue engineering[J].Biomaterials，2009，30（36）：6844-6853.

[14]Heimburgh D，Zachariah S，Heschel I，et al. Human preadipocytes seeded on freeze-dried collagen scaffolds investigated in vitro and in vivo[J].Biomaterials，2001，22（5）：429-438.

[15]Lin S，Wang K，Kao A.Engineered adipose tissue of predefined shape and dimensions from human adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Tissue Engineering Part A，2008，14（5）：571-581.

[16]Cho S，Song K，Rhie J，et al.Engineered adipose tissue formation enhanced by basic fibroblast growth factor and a mechanically stable environment [J].Cell Transplant，2007，16（4）：421-434.

[17]Beahm E，Walton R.Issues， considerations， and trends in bilateral breast reconstruction [J].Plastic and Reconstructive Surgery，2009，124（4）：1064-1076.

[18]Rubin J，Bennett J，Doctor J，et al.Collagenous microbeads as a scaffold for tissue engineering with adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2007，120（2）：414-424.

[19]Vashi A，Keramidaris E，Abberton K，et al.Adipose differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells using Pluronic F-127 hydrogel in vitro [J].Biomaterials，2008，29（5）：573-579.

[收稿日期]2012-05-15 [修回日期]2012-07-20

編輯/李陽利