火炭母提取物抑菌活性的初步研究

歐陽蒲月，朱翠霞,陳功錫,鄧玲芳

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000;3.南藥資源保護(hù)與利用工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510520)

火炭母是蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物火炭母(PolygonumchinenseLinn.)的藥用全草,別名火炭毛、烏炭子、山蕎毒草、赤地利、老鼠蔗等,是民間常用的中草藥，廣泛分布于我國南部的福建、廣東、廣西和貴州等地區(qū)，生長于水溝邊、山谷、濕地上。性涼，味微酸、澀，有清熱解毒、利濕止癢、明目退翳之效，臨床上主要用于濕熱泄瀉、痢疾、黃疸、咽喉腫痛、濕熱瘡疹、霉菌性陰道炎等病癥的治療[1,2]。火炭母莖呈扁圓柱形,有分枝,長30～100 cm,節(jié)稍膨大,下部節(jié)上有須根;表面淡綠色或紫褐色,無毛,有細(xì)棱;質(zhì)脆,易折斷,斷面灰黃色,多中空；托葉鞘呈筒狀,膜質(zhì),先端偏斜[1]。已有人用 10％的火炭母滴眼液治療角膜薄翳、角膜斑翳等眼疾[3]?；鹛磕钢械乃幱贸煞种饕獮辄S酮、生物堿、芳香雜環(huán)類化合物等[4]。研究發(fā)現(xiàn)火炭母對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和綠膿桿菌具有一定的體外抑菌活性[5]和體外抗腫瘤活性[6]，但其抑菌及抗腫瘤藥效物質(zhì)并不十分明確。

目前，對火炭母的生藥學(xué)研究已經(jīng)比較透徹,對其所含化學(xué)成分的研究也有一定進(jìn)展。作者在此對火炭母提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，以期為提高火炭母的藥用價值以及后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

火炭母地上部分采自湘西自治州吉首大學(xué)后山，由吉首大學(xué)陳功錫教授鑒定為火炭母。室溫陰干，將葉與莖分離，65 ℃烘干，分別粉碎，過100目篩。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、藤黃球菌(Micrococcusluteus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(Moniliaalbicans)，湖南省疾病預(yù)防控制中心。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)24 h，以試管斜面培養(yǎng)基保存；真菌在29 ℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿中，保存，備用。

1.1.2 試劑

95％乙醇、無水甲醇、石油醚、乙醚、濃鹽酸、硼酸、氨水、NaOH、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨，均為國產(chǎn)分析純；黃連素，市售，四川亞寶光泰藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器

RE540 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Yamato；HM-205TOA型pH計；FD-1型冷凍干燥機(jī)；PW/10-002型培養(yǎng)箱；CCV-1311型超凈工作臺；SM-52型高壓蒸汽滅菌器；AEG-220型分析天平；索氏提取器。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)的提取

1.2.1.1 不同部位提取物

取不同部位材料各5 g，分別加入65％、95％乙醇溶液100 mL，先超聲提取30 min，然后45 ℃水浴30 min，趁熱過濾，濃縮至5 mL，得不同部位提取物(生藥濃度為1.0 g·mL-1)。

1.2.1.2 不同溶劑提取物

取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，分別用蒸餾水、無水甲醇、65％乙醇、95％乙醇作溶劑，按1.2.1.1方法提取，得不同溶劑提取物。

1.2.1.3 不同提取方法提取物

超聲提取物按1.2.1.1得到。

索氏提取物：取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，裝入索氏提取器的濾紙?zhí)淄仓?，加?00 mL 65％乙醇溶液，加沸石數(shù)粒，于80 ℃水浴加熱回流提取5 h，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容至5 mL，即得。

1.2.1.4 不同溶劑萃取物

稱取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料50 g，加入最佳提取溶劑500 mL，按1.2.1.1方法提取，重復(fù)1次，合并濾液，濃縮至50 mL，使生藥濃度為1.0 g·mL-1。濾液分別用石油醚、乙醚萃取(加萃取劑50 mL，混勻，靜置30 min)，取上層液，下層液再用萃取劑重復(fù)萃取2次，合并萃取液，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物，濃縮，以甲醇定容至50 mL，即得不同溶劑萃取物(生藥濃度為1.0 g·mL-1)。

1.2.2 抑菌活性測定

1.2.2.1 對細(xì)菌的抑菌活性測定

(1)含藥濾紙片的準(zhǔn)備

用打孔器將定性濾紙打成直徑為5 mm的小圓片，置培養(yǎng)皿內(nèi)高壓滅菌后，分別浸泡于不同供試藥液中，備用。陰性對照浸泡無菌水，陽性對照浸泡黃連素溶液。

(2)接種

用竹簽挑取細(xì)菌放入無菌水中成稀釋菌液，用移液器吸取120 μL稀釋菌液滴在直徑為9 cm的營養(yǎng)瓊脂平皿中央，用玻璃刮鏟將菌液均勻地涂布于整個平皿，于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)10～15 min至培養(yǎng)基表面干燥后，分別將含藥濾紙片均勻地放置在接種了不同受試菌的培養(yǎng)基表面(每皿放4片含藥濾紙片)，稍加按壓使之緊貼培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取出平皿，測量各紙片周圍抑菌圈直徑。

1.2.2.2 對真菌的抑菌活性測定

(1)含毒培養(yǎng)基的制備

在無菌條件下，取提取物5 mL、10 mL分別加入到25 mL 50 ℃左右的培養(yǎng)基中，充分振蕩混勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中。每濃度做2個重復(fù)，每種菌株抑菌實驗重復(fù)2次。對照培養(yǎng)基為空白培養(yǎng)基，即不加任何提取物，只加相應(yīng)體積的無菌水。

(2)接種培養(yǎng)

取培養(yǎng)基上生長5～7 d(菌絲均勻布滿培養(yǎng)基表面)的供試菌種，用直徑為5 mm的無菌玻璃管在菌落邊緣切取帶菌培養(yǎng)基(菌餅)，用接種針將菌餅分別接種至冷卻后的含毒培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，每個平皿接種菌餅1塊，置28 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d，待對照培養(yǎng)基中的菌絲體充分生長后(孢子不成熟)，測量處理組和對照組菌落直徑(按十字交叉法測量菌落直徑2次，取其平均值)，按下式計算抑菌率：

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測定

取1.2.1中抑菌效果最佳提取物制成含生藥濃度分別為4.0 g·mL-1、2.0 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.8 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.05 g·mL-1的試液，取各濃度試液0.1 mL加入到0.8 mL的液體培養(yǎng)基中，接入0.1 mL菌懸液，搖勻，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無細(xì)菌生長，無細(xì)菌生長的最小生藥濃度為最小抑菌濃度(MIC)。另設(shè)未加菌液為空白對照、黃連素為陽性對照。

從無細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基中取出0.1 mL涂布平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最小生藥濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同部位提取物的抑菌活性(表1)

由表1可知， 火炭母的葉與莖提取物均對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、 藤黃球菌有一定的抑制作用，其中葉提取物的抑制作用更強；火炭母對黑曲霉無抑制作用，但對白色念珠菌的抑制作用卻很好，這可能是因為火炭母對黑曲霉和白色念珠菌的抑制作用機(jī)制不同而造成的。

表1 火炭母不同部位提取物的抑菌活性比較

2.2 不同溶劑提取物的抑菌活性

不同溶劑提取火炭母的葉粉末所得到的提取物的抑菌活性比較見表2。

表2 不同溶劑提取物的抑菌活性比較

由表2可知，65％乙醇提取物對各菌的抑制作用最強；無水甲醇提取物次之；95％乙醇提取物再次之；蒸餾水提取物最弱。由此推測：火炭母的抑菌活性物質(zhì)可能具有表面活性，醇濃度太高或者用蒸餾水(不含醇類基團(tuán))都不利于其溶解釋出。

各菌的敏感性由強到弱依次為：金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>痢疾桿菌>藤黃球菌>枯草桿菌。這與李少基等[5]的研究結(jié)果相似。

2.3 不同提取方法提取物的抑菌活性(表3)

表3 不同提取方法提取物的抑菌活性比較

由表3可知，超聲提取物對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、白色念珠菌的抑制作用較索氏提取物強；但對于枯草桿菌、藤黃球菌的抑制作用卻相當(dāng)，這說明超聲提取和索氏提取對這兩種菌的有效抑菌成分的提取效果相當(dāng)。從整體來看，超聲提取物抑菌效果較強，這與黃國霞等[7]的研究結(jié)果相似。這表明提取時間、溶劑浸泡時間可能對抑菌活性物質(zhì)的提取沒有多大影響；也有可能在索氏提取過程中提取出來了一些與抑菌活性物質(zhì)相互影響的化學(xué)成分，影響了抑菌效果。

2.4 不同溶劑萃取物的抑菌活性(表4)

由表4可知，乙醚萃取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、藤黃球菌、痢疾桿菌、白色念珠菌的抑制作用較強，遠(yuǎn)大于陽性對照黃連素；石油醚萃取物對以上5種菌也有一定的抑制作用；乙醚萃取物和石油醚萃取物對黑曲霉均無抑制作用；萃余物對各菌均無抑制作用。這些表明火炭母的抑菌活性物質(zhì)易溶于非極性溶劑。乙醚對減弱抑菌活性的貢獻(xiàn)最大，石油醚次之，這兩種溶劑能夠?qū)⒁志钚晕镔|(zhì)萃取完全。因此，提取抑菌成分時，應(yīng)選用這類非極性溶劑。

2.5 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)(表5)

表4 不同溶劑萃取物的抑菌活性比較

由表5可知，火炭母提取物對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、 藤黃球菌、白色念珠菌的最小抑菌濃度(g·mL-1)分別為0.6、0.6、0.8、1.0、0.6；對5種菌的最小殺菌濃度均為1.0 g·mL-1。

表5 火炭母提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 結(jié)論

對火炭母提取物的抑菌活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)火炭母的抑菌活性物質(zhì)存在于葉和莖中，但葉提取物的抑菌活性更高；(2)不同溶劑提取物中，65％乙醇提取物具有最高的抑菌活性；(3)超聲提取物的抑菌效果較索氏提取物稍強；(4)提取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚、石油醚等非極性溶劑；(5)火炭母提取物對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、藤黃球菌、白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.6 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.6 g·mL-1，最小殺菌濃度(MBC)均為1.0 g·mL-1。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草(第二卷)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：647-649.

[2] 任國珍，何世東.火炭母復(fù)方為主治療小兒急性細(xì)菌性痢疾52例[J].廣西中醫(yī)藥，2001，24(1):32.

[3] 徐國鈞，何宏賢．中國藥材學(xué)(下冊)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1996：1371.

[4] 謝賢強，吳萍，林立東，等.火炭母化學(xué)成分的研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報,2007，15(5)：450-454.

[5] 李少基，陳武，陳足金，等.12種中草藥的體外抑菌試驗[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，(1):44.

[6] 韋金育，李延，韋濤，等.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫廇作用的篩選研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003，6(4):3-7.

[7] 黃國霞,劉柳,汪青,等.火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，50(12):2490-2492.