蘇勝彥，董在杰,3，袁新華，梁政遠(yuǎn)，曲疆奇，張建橋， 劉 偉， 馬良驍，徐 跑

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫214081； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心∥農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214081；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

建鯉作為經(jīng)國家審定的我國第一個(gè)人工育成的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其生長(zhǎng)速度快，抗病力強(qiáng)。然而經(jīng)過十幾年的推廣，迫切需要進(jìn)一步的遺傳改良，進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的更新。而雜交育種是目前成效比較顯著的鯉育種方法之一[1-2]，建鯉、豐鯉、荷元鯉等就是雜種優(yōu)勢(shì)利用的成功典范[3]。國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目和國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目等都將建鯉的遺傳改良列入其中，并在2010年獲得福瑞鯉水產(chǎn)良種。而建鯉生長(zhǎng)速度的分子標(biāo)記，尤其是是改良過程中超顯性優(yōu)勢(shì)相關(guān)分子標(biāo)記，已成為提高建鯉選育效率的重要途徑。

IGF2(類胰島素生長(zhǎng)因子2，Insulin-like growth factorⅡ，IGFⅡ)是一種促細(xì)胞分裂多肽，其結(jié)構(gòu)與胰島素相類似[4]，在所有胰島素的靶細(xì)胞中發(fā)揮類胰島素的功能。除此之外，更為重要的是其可作為生長(zhǎng)激素的中間信使，傳遞生長(zhǎng)激素，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育起作用[5]。在動(dòng)物上，IGF2 的表達(dá)水平與動(dòng)物骨骼肌的發(fā)育調(diào)控有關(guān)[6]，是影響豬產(chǎn)肉性能的主要功能基因之一。

在魚上，虹鱒的IGF2 cDNA被首次克隆出來的[7]，此后，鯛[8]，澳洲肺魚[9]，羅非魚[10]，杜父魚[11]，斑馬魚[12]，河豚[13]，大菱鲆[14]，大麻哈魚[15]等多種硬骨魚類和軟骨魚類的IGF-2被全部或部分克隆。2002，Tse等[16]克隆了鯉魚IGF2序列，并對(duì)其組織表達(dá)做了分析。對(duì)于魚類的IGF2基因結(jié)構(gòu)，大麻哈魚[15]，澳洲肺魚[9]和河豚(基因庫新No.AL021880)已經(jīng)確定。大麻哈魚，澳洲肺魚和河豚的IGF-2基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，分別跨越約7.9、5.5、4.2 kb染色體DNA。

IGF-2基因在未成熟的和成熟的硬骨魚的肝組織和非肝組織中充分表達(dá)，包括鯉魚[16]，虹鱒魚[17]，斑馬魚[12]，杜父魚[11]，羅非魚[18]，鯛[19]及河豚[13]。在虹鱒魚的肝，腸道組織(體內(nèi))和培養(yǎng)的肝細(xì)胞(體外)[20]以及在鯉魚的腦，鰓，腸，腎，肝，肌肉[16]中用GH處理，可增加IGF2 mRNA含量。Chen等[21]用重組IGF2腹腔注射羅非魚5周后，體質(zhì)量和體長(zhǎng)分別較對(duì)照組增加了72％和34％。這些說明，IGF2基因表達(dá)量與魚類生長(zhǎng)速度密切相關(guān)，這就為建鯉高生長(zhǎng)速度的特性提供研究途徑。

慢病毒載體( lentiviral vector)源于HIV1[22-23],是以慢病毒基因組為基礎(chǔ)，除去其復(fù)制所需的基因，以治療性基因和選擇性標(biāo)記物構(gòu)建而成，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，無毒性且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，不僅能感染分裂細(xì)胞，且能轉(zhuǎn)染終末分化細(xì)胞和非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜和肝細(xì)胞等)，整合于靶細(xì)胞基因組的目的基因能夠長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)[24]。慢病毒載體常常用于研究基因表達(dá)的調(diào)控[25]、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作[26]、疾病機(jī)理與治療[27]等。其中，慢病毒載體用于基因功能的研究[28-30]，功能基因用于疾病治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)[31]、農(nóng)業(yè)上提高生產(chǎn)性能[32-33]等方面成為其應(yīng)用的熱點(diǎn)。因此，通過注射IGF2基因慢病毒載體將是研究IGF2基因體內(nèi)、體外過表達(dá)的重要手段。

本研究利用PCR擴(kuò)增的方法,根據(jù)斑馬魚IGF2基因序列的剪切方式,在鯉IGF2b基因mRNA序列上設(shè)計(jì)4對(duì)引物,首次克隆測(cè)序了鯉該基因的全部?jī)?nèi)含子,并推斷出鯉IGF2b基因的結(jié)構(gòu);分析了該基因序列的CpG島和重復(fù)序列,并構(gòu)建了IGF2基因的慢病毒載體，為研究IGF2b基因在鯉生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)肉性能等方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興試驗(yàn)基地。試驗(yàn)所用細(xì)胞株為293T細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基為DMEM+10％FBS(w)，使用的質(zhì)粒載體為pLenti6.3- IRES-EGFP質(zhì)粒。

1.2 總DNA提取和PCR擴(kuò)增，測(cè)序

鯉基因組總DNA提取采用Takara全血基因組試劑盒，后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，用分光光度計(jì)測(cè)算DNA濃度。根據(jù)鯉IGF2基因的cDNA序列(AF402958)設(shè)計(jì)引物(見表1)。

表1 鯉IGF2b cDNA和DNA擴(kuò)增所需引物

PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包括 10×buffer 15 μL，Mg2+(25 m mol/L)1 μL， dNTPs(各 2 mmol/L )1 μL， 上下游引物(10 mmol/L )各1 μL模板 DNA 1 μL， TaqDNA聚合酶(Promega)1 U,補(bǔ)dd H2O至反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)均在TAKARA公司梯度PCR儀上完成，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性20 s，退火溫度48～58 ℃ 20 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min 將反應(yīng)后的 PCR 產(chǎn)物用w=8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合goldview顯色進(jìn)行檢測(cè)，溴酚藍(lán)為上樣液(w=0.25％溴酚藍(lán)，w=40％蔗糖水溶液)，UVP掃描儀掃描成像，拍照，送往公司測(cè)序。

1.3 慢病毒載體的構(gòu)建

1.3.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 每50～100 mg組織加入1 mL Trizol，用勻漿器進(jìn)行勻漿，直至勻漿液無顆粒透明狀，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，然后小心吸取上清，并轉(zhuǎn)移至新的無RNase的離心管中。每管加入200 μL氯仿，用手上下顛倒ep管15 s，室溫靜置15 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min。吸取上清移至新的1.5 mL ep管，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20 ℃沉淀10 min。4 ℃，12 000 r/min離心10 min后，去上清，加入至少1 mL 4 ℃預(yù)冷的φ=75％乙醇，洗滌沉淀，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，棄上清。吸水紙吸去殘液，室溫干燥。加入20 μL RNase-free水，至完全溶解，紫外分析測(cè)定所抽提RNA的濃度。根據(jù)Fermentas公司的M-MLV 操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2IGF2b基因CDS區(qū)擴(kuò)增 針對(duì)鯉IGF2b基因(AF402958)的CDS(Coding domain sequence )區(qū)序列設(shè)計(jì)并合成PCR 引物(序列見表2)，并在目的基因的5’端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3’端添加NheI酶切位點(diǎn)。

表2 擴(kuò)增IGF2b基因編碼區(qū)全長(zhǎng)的引物序列

PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括 10×buffer 5 μL，Mg2+(25 m mol/L)2 μL， dNTPs(各 2 mmol/L )1 μL，上下游引物(10 mmol/L )各1 μL模板 DNA 1 μL， TaqDNA聚合酶(Promega)1 U,補(bǔ)dd H2O至擴(kuò)增反應(yīng)體系，在TAKARA公司梯度PCR儀上完成，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，退火溫度58 ℃ 20 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min 將反應(yīng)后的 PCR 產(chǎn)物用w=8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合goldview顯色進(jìn)行檢測(cè)，溴酚藍(lán)為上樣液(w=0.25％溴酚藍(lán)，w=40％蔗糖水溶液)，UVP掃描儀掃描成像，拍照，然后用T載體連接，后將菌落PCR呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系如下：10×Buffer Tango 2 μL，重組質(zhì)粒1 μg，限制性內(nèi)切酶BamH 10.25 μL，限制性內(nèi)切酶NheⅠ 0.25 μL，補(bǔ)ddH20至20 μL。將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.3 慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-IGF2b-IRES-EGFP的構(gòu)建 與上述方法類似，以T-IGF2b載體為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，在目的片段兩端添加酶切位點(diǎn)BamHI和NheI。PCR反應(yīng)體系和循環(huán)體系參照上文所述。回收PCR產(chǎn)物，用BamHI和NheI雙酶切PCR回收產(chǎn)物及載體pLenti6.3- IRES-EGFP，將酶切回收的目的基因IGF2b片段與pLenti6.3- IRES-EGFP連接，室溫連接4 h。取10 μL連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，后將菌落PCR鑒定呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，保留測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒。

1.3.4 慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染193T細(xì)胞 將測(cè)序正確的pLenti-IGF2b-IRES-EGFP及對(duì)照質(zhì)粒pLenti-EGFP 菌液劃線培養(yǎng)，并測(cè)定質(zhì)粒濃度：質(zhì)粒DNA 最終溶于除菌的TE 中，以Thermo Nanodrop儀器測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度，保證抽提質(zhì)粒的濃度在1 μg/μL左右。

轉(zhuǎn)染時(shí)(細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁牢，密度在50-70％時(shí)可用于轉(zhuǎn)染)，向無菌的1.5 mL離心管中加入750 μL Opti-MEM，然后向其中加入所制備的各DNA 溶液，慢病毒表達(dá)質(zhì)粒6 μg，包裝質(zhì)粒Packaging Mix 6 μg，混合均勻，在室溫下溫育5 min。同時(shí)，在另一無菌的1.5 mL離心管中加入750 μL Opti-MEM，向其中加入POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent 24 μL ，輕輕混勻，室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA 與稀釋后的POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。此步必須在5 min之內(nèi)混合，混勻后，在室溫下溫育20 min，以便形成DNA 與POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent 的復(fù)合物。取1.5 mL DNA與POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent混合液均勻地滴加在293T 細(xì)胞的培養(yǎng)液中，前后左右搖勻，于37 ℃,φ=5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染后 48 h(轉(zhuǎn)染即可為0 h計(jì)起)，收集293T 細(xì)胞上清液(第1次收液)。細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至72～80 h，收集病毒上清，與第1次收集的混合，共20 mL。于 4 ℃，3 000 r/min 離心10 min，除去細(xì)胞碎片，每管裝1 mL病毒，-80 ℃保存。

1.3.5 慢病毒滴度測(cè)定(熒光顯微鏡觀察法)感染前1 d，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),準(zhǔn)備5×105細(xì)胞/mL 的293T細(xì)胞接種24孔板，每孔0.5 mL。細(xì)胞接種后第2天，根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備3個(gè)無菌的EP管，10倍倍比稀釋慢病毒濃縮液。

13 μL 慢病毒原液 + 117 μL DMEM → 10-1病毒液

13 μL 10-1病毒液 + 117 μL DMEM → 10-2病毒液

細(xì)胞換液，每孔內(nèi)加入500 μL無抗生素的DMEM+10％FBS(w)培養(yǎng)液，除control組外其余各孔均加入polybrene至終濃度為8 μg/mL。各感染孔內(nèi)分別加入相應(yīng)稀釋度的病毒液及病毒原液100 μL，放入37 ℃、φ=5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。感染24 h后，換液，每孔內(nèi)加入500 μL DMEM + 10％ FBS(w)+ 1％ Pen-Strep(w)，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育。感染72 h后觀察熒光表達(dá)情況，選取合適的稀釋度對(duì)應(yīng)的孔，對(duì)GFP陽性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并依此計(jì)算待測(cè)慢病毒的滴度。

計(jì)算滴度：

計(jì)算感染形成單位(ifu/mL)：

1.3.6 病毒液目的基因檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104)接種于24-well 中，37 ℃φ=5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約80％。分別加入50 μL目的及對(duì)照病毒液，同時(shí)加入終質(zhì)量濃度為8 μg/mL的Polybrene促進(jìn)感染。感染24 h后，換液，每孔內(nèi)加入500 μL DMEM + 10％ FBS(w)+ 1％ Pen-Strep(w)，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育。感染48 h后觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況，并拍照記錄感染結(jié)果。后收集細(xì)胞用于RNA提取。此時(shí)熒光率應(yīng)該大于80％者，若感染效率低于80％的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。棄細(xì)胞上清，每孔加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，抽提RNA，經(jīng)DNaseI處理后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGF2b基因表達(dá)。

表3 熒光定量PCR所需引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

序列比對(duì)通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast進(jìn)行，CpG島預(yù)測(cè)通過在線軟件MethPrimer進(jìn)行，重復(fù)序列預(yù)測(cè)采用RepeatMasker進(jìn)行；試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Microsoft Excel表中初步整理后，使用SAS8.0分析。

2 結(jié) 果

2.1 IGF2b基因組DNA序列

依據(jù)鯉IGF2基因的cDNA序列(AF402958)設(shè)計(jì)引物(表1)，從鯉基因組DNA中獲得的擴(kuò)增片段回收測(cè)序，獲得5 173 bp長(zhǎng)度的基因組DNA序列(圖1)。本序列已提交給GenBank(Accession No.HM755899)。從圖1可以看出,鯉IGF2b基因的基因有內(nèi)含子為3個(gè),長(zhǎng)度分別為1 275、1 825、878 bp。

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CTTTTAGTCCTTTTACATACTAGTTTGCACCTGTAACTATAAA

GGGACATCCACACTGTAAGGAATTGTTGTAAAATTAGATTCC

TGTTCCAGCACCTTGTAATCACAAATGAAAAGCAGAGAAGA

ATCTGCGAATTGCACATCGCCACGGATTACGTCCAAGT

圖1IGF2b基因的DNA序列

Fig.1 DNA sequence forIGF2bgene(斜體小寫字母表示內(nèi)含子序列)

2.2 DNA序列分析

鯉IGF2bDNA序列在GeneBank上比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與斑馬魚IGF2b基因(NW_003041001.1)相比，相似性為88％；都有3個(gè)內(nèi)含子，其長(zhǎng)度不同。通過在線軟件MethPrimer軟件進(jìn)行該序列的CpG島預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在區(qū)域4 497-4 504和 4 878-4 979上有2個(gè)CpG島，全部位于3‘非翻譯區(qū)。通過在線軟件RepeatMasker預(yù)測(cè)其重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)在區(qū)域46-86上存在(T)n重復(fù)。

2.3 慢病毒載體的構(gòu)建

2.3.1 鯉IGF2b基因的ORF(open reading frame)克隆和重組克隆的菌落PCR鑒定 根據(jù)基因庫鯉IGF2b基因序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其CDS區(qū)，用連接PCR產(chǎn)物后的T載體做模板，擴(kuò)增IGF2b基因電泳圖見圖1，而進(jìn)行慢病毒載體包裝后的質(zhì)粒載體做模板獲得的電泳圖見圖2。從圖1和圖2中可以看出，2次獲取的基因片度長(zhǎng)度是一致的，而且重復(fù)性也好。經(jīng)過測(cè)序與已知序列一致。

圖2 T-IGF2b重載體菌落PCR產(chǎn)物鑒定

圖3 pLenti6.3-IGF2b-IRES-EGFP重組載體菌落PCR鑒定

2.3.2 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 構(gòu)建的IGF2b基因慢病毒載體感染193T細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察圖如下：從圖中可以看出，對(duì)照和含有IGF2b基因的質(zhì)粒均有GFP表達(dá)，說明包裝沒有問題，但I(xiàn)GF2b的表達(dá)還需進(jìn)行收毒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2.3.3 慢病毒滴度測(cè)定 為了確定構(gòu)建的慢病毒載體的濃度，并能為下步慢病毒感染細(xì)胞、活魚做基礎(chǔ)，我們用熒光顯微鏡進(jìn)行了滴度測(cè)定。本文從20倍物鏡×10倍目鏡下，從10-2孔內(nèi)各隨機(jī)選取3個(gè)視野，加入病毒液的體積=100 μL，獲得了pLenti-IGF2b的滴度為：ifu/mL =5.54 ×106，而陰性對(duì)照Lenti-EGFP NC滴度為：3.04 ×106。

2.3.4IGF2基因在293T細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè) 為了檢測(cè)構(gòu)建的慢病毒載體對(duì)細(xì)胞的感染能力，本文通過RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)了IGF2b基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖4-6)，圖5為IGF2b基因以及內(nèi)參基因hACTB的擴(kuò)增曲線，圖6為這2基因的溶解曲線，從圖中可以看出擴(kuò)增曲線為光滑的S形曲線，溶解曲線為單一峰值，故特異性和擴(kuò)增量都滿足要求。從圖7可以看到，用構(gòu)建的IGF2b基因慢病毒載體感染293T細(xì)胞后，檢測(cè)到了IGF2b基因的表達(dá)，從而證明了構(gòu)建的IGF2b基因慢病毒載體是成功的。

圖7 Lenti-IGF2b感染293T的表達(dá)檢測(cè)

3 討 論

3.1 鯉IGF2基因的結(jié)構(gòu)

本文通過基因庫中Blast檢測(cè)鯉IGF2基因的序列的同源性，發(fā)現(xiàn)其更接近于斑馬魚IGF2b基因。因此，本文選用建鯉作為試驗(yàn)材料，以該基因在斑馬魚上的剪切方式設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增鯉魚IGF2b基因的內(nèi)含子。同時(shí)本課題組以斑馬魚IGF2a基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出了IGF2a序列。因此，本文擴(kuò)增出的內(nèi)含子是鯉IGF2b基因的內(nèi)含子。

鯉IGF2b基因的基因有內(nèi)含子為3個(gè)，長(zhǎng)度分別為1 275、1 825、878 bp。這個(gè)結(jié)果與大麻哈魚[15]，澳洲肺魚[9]和河豚(基因庫新No.AL021880)已經(jīng)確定的IGF2基因結(jié)構(gòu)一致。另外，在鯉IGF2b3′非翻譯區(qū)域存在2個(gè)CpG島，內(nèi)含子中沒有檢測(cè)到CpG島。通過在線軟件RepeatMasker預(yù)測(cè)其重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)在區(qū)域46-86上存在(T)n重復(fù)，位于5′非翻譯區(qū)。

3.2 鯉Lenti-IGF2b-IRES-EGFP載體

目前，普遍使用的載體系統(tǒng)包括病毒載體和非病毒載體兩類，其中非病毒載體安全性較高，但是轉(zhuǎn)染效率低[34]，而病毒載體應(yīng)用較為普遍[25-26,32,35]。與其它病毒載體相比，慢病毒載體最大的特點(diǎn)就是強(qiáng)大的穿透性[36],并能感染非分裂期細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定表達(dá),因此越來越受到神經(jīng)科學(xué)、基因功能研究、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重視[25-26,28,32,37]。因此本文采用分子克隆的方法成功構(gòu)建了一種新型的慢病毒載體質(zhì)粒Lenti-IGF2b-IRES-EGFP,并利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法產(chǎn)生了完整的慢病毒載體。Lenti-IGF2b-IRES-EGFP載體含有GFP報(bào)告基因，具有很強(qiáng)的實(shí)用性，同時(shí)GFP報(bào)告基因以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)，其表達(dá)效率高,能達(dá)到95％以上，觀察結(jié)果方便快捷，為后續(xù)研究，尤其是研究IGF2基因過表達(dá)對(duì)鯉生產(chǎn)性能的作用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]BAKES J,GORDA S.Genetic improvement of common carp strains using intraspecific hybridization[J].Aquaculture,1995,129:183-186.

[2]LINHART O,GELA D,RODINA M,et al.Top-crossing with paternal inheritance testing of common carp(CyprinuscarpioL.)progeny under two altitude conditions[J].Aquaculture,2002,204: 481-491.

[3]樓允東.魚類育種學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:40-107.

[4]RINDERNECHT E,HUMBEL R E.The amino acid sequence of human insulin like growth factor 1 and its structural homology with proinsulin[J].J Biol Chem,1978,253(8):2769-2776.

[5]VASILATOS Y R,SCANES CG.Growth hormone and insulin-like growth factor in poultry growth: required,optimal or ineffective[J].Poultry Sci,1991,70: 1764-1780.

[6]FLORINI J R ,EWTON D Z ,MCWADE F J.IGFs,muscle growth ,and myogenesis[J].Diabetes Rev,1995,3:73-92.

[7]SHAMBLOTT M J,CHEN T T.Identification of a second insulin-like growth factor in a fish species [J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:8913-8917.

[8]DUGUAY S J,LAI-ZHANG J,STEINER D F,et al.Developmental and tissue-regulated expression of IGF-I and IGF-II mRNAs in Sparus aurata[J].J Mol Endocrinol,1996,16: 123-132.

[9]COLLET C,CANDY J,RICHARDSON N,et al.Organization,sequence,and expression of the gene encoding IGFII from Barramundi(Teleostei; Lates calcarifer)[J].Biochem Genet,1997,35: 211-224.

[10]CHEN J Y,CHANG C Y,CHEN J C,et al.Production of biologically active recombinant tilapia insulin-like growth factor-II polypeptides in Escherichia coli cells and characterization of the genomic structure of the coding region[J].DNA Cell Biol,1997,16: 883-892.

[11]LOYNG-CUENI D,SCHMID A C,REINECHE M.Molecular cloning and tissue expression of the insulin-like growth factor II prohormone in the bony fish Cottus scorpius[J].Gen Comp Endocrinol,1999,113: 32-37.

[12]MAURES T,CHAN S J,XU B,et al.Structural,biochemical,and expression analysis of two distinct insulin-like growth factor I receptors and their ligands in zebrafish[J].Endocrinology,2002,143: 1858-1871.

[13]AYSON F G,DE-JESUS E G,MORIYAMA S,et al.Differential expression of insulin-like growth factor I and II mRNAs during embryogenesis and early larval development in rabbitfish,Siganus guttatus[J].Gen Comp Endocrinol,2002,126: 165-174.

[14]DUVAL H,ROUSSEAU K,ELIES G,et al.Cloning,characterization,and comparative activity of turbot IGF-I and IGF-II[J].Gen Comp Endocrinol,2002,126: 269-278.

[15]PALAMARCHUK A,GRITSENKO O,HOLTHUIZEN E,et al.Complete nucleotide sequence of the chum salmon insulin-like growth factor II gene[J].Gene,2002,295: 223-230.

[16]TSE M C,VONG Q P,CHENG C H,et al.PCR-cloning and gene expression studies in common carp(Cyprinus carpio)insulin-like growth factor-II[J].Biochim.Biophys.Acta,2002,1575: 63-74.

[17]AEGERTER S,JALABERT B,BOBE J.Messenger RNA stockpile of cyclin B,insulinlike growth factor I,insulin-like growth factor II,insulin-like growth factor receptor Ib,and p53 in the rainbow trout oocyte in relation with developmental competence[J].Mol Reprod Dev,2004,67: 127-135.

[18]CAELERS A,SCHMID A C,HRUSOVSKY A,et al.Insulin-like growth factor II mRNA is expressed in neurones of the brain of the bony fish Oreochromis mossambicus,the tilapia[J].Eur J Neurosci,2003,18: 355-363.

[19]PERROT V,MOISEEVA E B,GOZES Y,et al.Insulin-like growth factor receptors and their ligands in gonads of a hermaphroditic species,the gilthead seabream(Sparus aurata): Expression and cellular localization[J].Biol Reprod,2000,63: 229-241.

[20]SHAMBLOTT M J,CHENG C M,BOLT D,et al.Appearance of insulin-like growth factor mRNA in the liver and pyloric ceca of a teleost in response to exogenous growth hormone[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92: 6943-6946.

[21]CHEN J Y,CHEN J C,CHANG C Y,et al.Expression of recombinant tilapia insulin-like growth factor 1 and stimulation of juvenile tilapia growth by injection of recombinant IGFs polypeptides[J].Aquaculture,2000,181: 347-360.

[22]WONG L F,GOODHEA L,PRAT C,et al.Lentivirus-mediated gene transfer to the centralnervous system: therapeutic and research applications[J].Hum GeneTher,2006,17(1): 1-9.

[23]JAKOBSSON J,LUNDBERG C.Lentiviral vectors for use in the central nervous system[J].Mol Ther,2006,13(3): 484

[24]COCKRELL A S,KAFRI T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol,2007,36(3):184-204.

[25]CHUMAKOV S P,KRAVCHENKO J E,PRASSOLOV V S,et al.Ef?cient downregulation of multiple mRNA targets with a single shRNA-expressing lentiviral vector[J].Plasmid,2010,63: 143-149.

[26]RAMOS O S,CARRATALA Y P,PUERTA S G,et al.Dual promoter lentiviral vector generates transgenic mice expressing E2-CSFV glycoprotein in their milk,but impairs early identi?cation of transgenic embryos[J].Theriogenology,2011.

[27]WITCHER M,EMERSON B M.Epigenetic Silencing of the p16INK4a Tumor Suppressor Is Associated with Loss of CTCF Binding and a Chromatin Boundary[J].Molecular Cell,2009,34,271-284.

[28]ZHANG L,PROCUIK M,FANG T,et al.Functional analysis of the quantitative expression of a costimulatory molecule on dendritic cells using lentiviral vector-mediated RNA interference[J].Journal of Immunological Methods,2009,344: 87-97.

[29]劉真，甄艷，于曉黎，等.人NESG1基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在293FT細(xì)胞中的表達(dá)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31：65-68

[30]湯展毅，嚴(yán)云勤，高學(xué)軍，等.牛myf6基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在成肌細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,43(13):2793-2799.

[31]MOTONO M,YAMADA Y,HATTORI Y,et al.Production of transgenic chickens from purified primordial germ cells infected with a lentiviral vector[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109: 315-321.

[32]KEEN J E,HUNGERFORD L L,LITTLEDIKE E T,et al.Effect of ewe ovine lentivirus infection on ewe and lamb productivity[J].Preventive Veterinary Medicine,1997,30: 155-169.

[33]BLASCO A.The role of genetic engineering in livestock production[J].Livestock Science,2008,113: 191-201.

[34]沈媛，彭輝，馮敏，等.構(gòu)建HMGB1/PEI非病毒載體介導(dǎo)高效基因傳遞的研究[J] .中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，48(5):91-96.

[35]鐘建輝，銀巍，藏林泉，等.腺病毒載體介導(dǎo)的大鼠DNA多聚酶p重組體的構(gòu)建及其在PC12細(xì)胞中的表達(dá)[J] .中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2005，6(26):622-625.

[36]AZZOUZ M,KINGSMAN S M,MAZARAKIS N D.Lentiviral vectors for treating andmodeling human CNS disorders[J].J GeneMed,2004,6(9): 951-962.

[37]VERCAMMEN L,VAN DERPERREN A,VAUDANO E,et al.Parkin protects againstneurotoxicity in the 6-hydroxydopamine ratmodel forParkinson’s disease[J].MolTher,2006,14(5): 716-723.