趙 東 徐桂芳 鄒曉平

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃黏膜淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤等疾病的重要致病因素。目前，臨床采用口服質(zhì)子泵抑制劑、兩種抗生素的三聯(lián)療法作為根除H.pylori的一線療法，根除率可達65%～80%，但該方案在治療過程中常發(fā)生抗生素相關(guān)的胃腸道不良反應，如腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、便秘等，且隨著耐藥菌株的大量出現(xiàn)，治療失敗的情況逐漸增多。

近20年來微生態(tài)制劑的研制取得了較大進展，并廣泛應用于臨床。多項研究［1～3］發(fā)現(xiàn)，益生菌不但在體外可有效抑制H.pylori，而且在體內(nèi)能明顯降低H.pylori的感染密度，減輕炎癥反應。臨床研究［4，5］發(fā)現(xiàn)，益生菌聯(lián)合傳統(tǒng)三聯(lián)療法可明顯提高H.pylori根除率，并降低不良反應的發(fā)生率，但其具體作用機制仍未闡明。本研究通過采用乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌聯(lián)合標準三聯(lián)療法治療感染H.pylori的小鼠模型，并觀察治療后Th1細胞免疫誘導的致炎因子白細胞介素(IL)-8、干擾素(IFN)-γ以及Th2細胞應答產(chǎn)生抗炎因子IL-4、IL-10含量的變化，旨在初步探討益生菌治療H.pylori感染的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物、試劑和藥品

4～6周齡SPF級C57BL/6小鼠32只，雌性，體質(zhì)量18～25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，于SPF級動物飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)。H.pylori標準株NCTC11673、益生菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌)均由上海信誼藥業(yè)有限公司惠贈。腦心浸液瓊脂粉(BD公司)，無菌脫纖維羊血購自湘臨檢驗中心，快速尿素酶試劑、小鼠ELISA試劑盒(聯(lián)科生物科技有限公司)。阿莫西林膠囊(500 mg/粒)(珠海億邦制藥股份有限公司)，克拉霉素片劑(125 mg/片)(揚子江藥業(yè)集團)，埃索美拉唑腸溶片(20 mg/片)(阿斯利康制藥有限公司)。

二、方法

1.制備H.pylori培養(yǎng)基:①腦心浸液血平板:稱取腦心浸液瓊脂粉10.4 g加入250 mL蒸餾水溶解后，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后加入10 mL無菌脫纖維羊血，混勻后澆注于無菌培養(yǎng)皿，4℃冷藏備用;②MRS固體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，牛肉粉5 g，酵母浸液2.5 g，葡萄糖10 g，K2HPO42.5 g，檸檬酸銨1 g，NaCl 2.5 g，MgSO40.25 g，MnSO40.1 g，Tween-800.5 g，以蒸餾水500 mL溶解后加瓊脂粉10 g，高壓蒸汽滅菌20 min，置于無菌培養(yǎng)皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.H.pylori培養(yǎng)和菌液制備:①H.pylori培養(yǎng)傳代:H.pylori復蘇后取長勢良好者密集接種于腦心浸液血平板，置于厭氧箱中微需氧環(huán)境(50 mL/L O2，850 mL/L N2，100 mL/L CO2)培養(yǎng) 48 h。②細菌懸液制備:無菌接種環(huán)從腦心浸液血平板上收集H.pylori菌落以無菌0.9%NaCl溶液制成混懸液，采用比濁管法調(diào)整菌懸液濃度為1×109CFU/mL。

3.益生菌懸液、藥液的配制:無菌接種環(huán)收集MRS培養(yǎng)平板上的菌株，用0.9%NaCl溶液配成懸液，濃度調(diào)整為1×109CFU/mL。各種藥物劑量按人與小鼠之間的用藥劑量換算，埃索美拉唑(20 mg)采用0.9%NaCl溶液稀釋成濃度為0.6 mg/mL的溶液，克拉霉素(125 mg)為 15.15 mg/mL，阿莫西林(500 mg)為30.3 mg/mL。

4.實驗動物分組和干預:32只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、標準三聯(lián)治療組、聯(lián)合治療組，每組各8只。后三組小鼠禁食12 h，以H.pylori懸液0.2 mL隔天灌胃，連續(xù)2個月，以誘導 H.pylori感染模型。正常對照組小鼠以等體積無菌0.9%NaCl溶液灌胃。造模成功后，模型組小鼠每天給予0.9%NaCl溶液 0.6 mL，連續(xù) 14 d;標準三聯(lián)治療組小鼠每天予埃索美拉唑、克拉霉素和阿莫西林各0.2 mL灌胃后禁食4 h，連續(xù)7 d。聯(lián)合治療組在給予標準7 d三聯(lián)治療的基礎上，先予2%NaHCO3溶液0.1 mL灌胃，再予1×109CFU/mL 乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌懸液0.2 mL灌胃，連續(xù)14 d;正常對照組小鼠不予任何干預。治療4周后，斷頸法處死小鼠取胃，用于后續(xù)實驗。

5.H.pylori感染的鑒定:采用快速尿素酶試驗、Giemsa染色以及細菌培養(yǎng)檢測H.pylori，三項檢查中至少兩項陽性判斷為H.pylori感染。治療結(jié)束4周后，再行快速尿素酶試驗、Giemsa染色、細菌培養(yǎng)，3項均陰性為成功根除H.pylori。

6.組織病理學檢查:各組小鼠處死后取胃體、胃竇組織用4%中性甲醛固定，常規(guī)HE染色，病理科醫(yī)生雙盲閱片。行胃黏膜慢性炎癥評分［6］。

7.ELISA法:取小鼠胃黏膜組織500 mg，勻漿后離心取上清。采用ELISA法測定小鼠胃黏膜IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10含量，具體步驟按說明書操作。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、H.pylori根除率

聯(lián)合治療組小鼠的H.pylori根除率為87.8%(7/8)，顯著高于標準三聯(lián)治療組的62.5%(5/8)(P＜0.05);模型組根除率為0，正常對照組無小鼠感染H.pylori(見圖1)。

圖1 治療后聯(lián)合治療組和模型組Giemsa染色(×400)

二、胃黏膜慢性炎癥評分

造模后，模型組小鼠胃黏膜慢性炎癥評分顯著高于正常對照組(2.33 ±0.45 對 0.11 ±0.04，P ＜0.05);標準三聯(lián)治療組(1.81 ±0.28)和聯(lián)合治療組(1.07±0.26)評分顯著低于模型組(P ＜0.05)，且聯(lián)合治療組又顯著低于標準三聯(lián)治療組(P＜0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P ＜0.05)。

模型組小鼠胃黏膜下層和黏膜固有層可見大量中性粒細胞浸潤，標準三聯(lián)治療組小鼠黏膜下層和黏膜固有層仍有中性粒細胞浸潤，聯(lián)合治療組小鼠黏膜固有層中性粒細胞浸潤明顯減輕，正常對照組小鼠胃黏膜無中性粒細胞浸潤(見圖2)。

圖2 各組小鼠胃黏膜組織病理學檢查(HE染色，×200)

三、胃黏膜 IL-8、IFN-γ 以及 IL-4、IL-10 含量

聯(lián)合治療組小鼠胃黏膜IL-8、IFN-γ含量較標準三聯(lián)治療組和模型組顯著下降［IL-8:(74.56±5.84)pg/mL 對(104.18 ±3.28)pg/mL 和(188.61 ±4.48)pg/mL，IFN-γ:(59.43 ± 2.07)pg/mL 對(107.32 ±3.06)pg/mL 和(169.82 ±3.81)pg/mL，P＜0.05］，但仍顯著高于正常對照組［分別為(1.35 ±0.46)pg/mL、(1.46 ±0.56)pg/mL］(P ＜0.05);標準三聯(lián)治療組小鼠胃黏膜 IL-8、IFN-γ 含量顯著低于模型組(P＜0.05)，亦顯著高于正常對照組(P ＜0.05)。

聯(lián)合治療組小鼠胃黏膜IL-4、IL-10含量與標準三聯(lián)治療組、模型組和正常對照組［IL-4:(43.46±3.62)pg/mL 對(4.63 ± 0.47)pg/mL、(3.37 ±0.33)pg/mL 和 (1.23 ± 0.27)pg/mL;IL-10:(74.21 ±2.27)pg/mL 對(5.24 ± 0.23)pg/mL、(4.51 ±0.42)pg/mL 和(4.73 ± 1.42)pg/mL］相比均顯著升高(P＜0.05)，而后三組之間IL-4、IL-10含量無明顯差異(P＞0.05)(見圖3)。

圖3 各組小鼠胃黏膜IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10含量

討 論

微生態(tài)制劑為H.pylori感染的治療提供了一種嶄新的思路。國內(nèi)外多項臨床研究和薈萃分析［7～10］報道，在標準三聯(lián)療法的基礎上加用益生菌可明顯提高H.pylori根除率。益生菌抑制H.pylori的可能機制為競爭營養(yǎng)素、競爭性占位、抑制性產(chǎn)物(如乳酸鹽、H2O2、短鏈脂肪酸和防御素)以及免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗通過成功建立H.pylori感染的小鼠模型，對益生菌在胃部的可能作用機制進行初步探討。

H.pylori定植于胃黏膜，其抗原持續(xù)刺激可引起局部特異性免疫反應。人體和動物實驗均證實H.pylori感染后胃黏膜發(fā)生以Th1型為主的免疫反應，對胃黏膜活檢標本分離的T細胞行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12分泌增多，而Th2型細胞因子 IL-4、IL-10 很少或缺乏［11，12］。但同時與正常人相比，H.pylori患者Th2免疫應答增強，Th1免疫應答受到抑制。這是機體抵御細菌感染而啟動的自我保護機制。H.pylori抗原與H.pylori感染者外周淋巴細胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，T細胞增生反應降低，IFN-γ和IL-2水平低于非感染者，而H.pylori感染者外周血和胃組織淋巴細胞的Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10 水平高于對照組［13，14］。這種現(xiàn)象表明機體在抵御外來抗原與限制自身組織損傷過程中同時存在Th1、Th2反應與炎癥反應自我平衡的過程，兩種免疫反應相互制約，其結(jié)果將決定疾病的結(jié)局。

IL-8可引起中性粒細胞趨化和脫顆粒造成黏膜局部炎癥，導致胃十二指腸潰瘍的發(fā)生和發(fā)展，且IL-8 mRNA表達以及胃黏膜組織含量與中性粒細胞浸潤程度相一致，根除H.pylori后胃黏膜IL-8水平明顯降低，中性粒細胞浸潤的平均密度亦顯著降低［15，16］。胃黏膜局部IL-8主要來源于胃黏膜上皮細胞，同時作為抵御外來病原體接觸機體的第一道屏障，一旦感染H.pylori便可誘發(fā)胃上皮細胞大量分泌IL-8，這可能是 H.pylori相關(guān)胃炎的始動因素。Th1應答分泌大量IFN-γ，增強各種炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞的活性，并釋放各種炎癥遞質(zhì)、細胞因子、活性氧簇和活性氮簇等，造成胃上皮損傷。減少IFN-γ可減輕H.pylori感染引起的炎癥。Smythies等［17］在體外用特異性抗體中和IFN-γ能明顯減輕H.pylori引起的炎癥，而IFN-γ-/-小鼠長期感染H.pylori后并未引起胃黏膜炎癥。本實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合益生菌治療可顯著降低胃黏膜IL-8、IFN-γ含量，且組織學示小鼠胃黏膜炎性反應明顯減輕，慢性炎癥評分亦顯著低于標準三聯(lián)療法。

IL-10是炎癥抑制因子和免疫調(diào)節(jié)因子。Chen等［18］的研究發(fā)現(xiàn)IL-10-/-小鼠胃黏膜 H.pylori的定植量較 IL-10+/-小鼠下降了100倍，血清 H.pylori特異性IgA、IgG抗體明顯增多，導致更嚴重的慢性胃炎，說明IL-10在保護組織免受損傷中起重要作用。Symthies等［17］系統(tǒng)研究了 H.pylori感染對不同免疫狀態(tài)小鼠的影響，從患者體內(nèi)分離的新鮮Ⅰ型H.pylori菌株(SPM326)感染 C57BL/6J野生型、SCID 以及 IFN-γ-/-、IL-4-/-、C57BL/10J、BALB/c 小鼠，結(jié)果顯示IL-4-/-小鼠以及野生型小鼠發(fā)生Th1型免疫反應，C57BL/10J、BALB/c小鼠發(fā)生Th0型反應，IFN-γ-/-小鼠發(fā)生Th2型免疫反應，胃黏膜炎癥依次減輕。用H.pylori尿素酶刺激各組小鼠培養(yǎng)的脾細胞懸液，分泌的細胞因子與H.pylori感染的胃黏膜一致。用H.pylori抗原刺激IFN-γ-/-小鼠，脾T細胞以分泌IL-4為主且胃黏膜炎癥最輕，而以H.pylori抗原刺激IL-4-/-小鼠，脾T細胞IFN-γ水平最高且胃黏膜炎癥最為嚴重。進一步說明IFN-γ與IL-4存在相互限制的作用。本研究中，聯(lián)合益生菌治療后，小鼠胃黏膜IFN-γ含量減少且 IL-4、IL-10含量明顯增多，提示益生菌在促進T細胞向Th2細胞分化方面起重要作用，能抑制IFN-γ水平并下調(diào)Th1型免疫反應，從而減輕由H.pylori感染所致的炎癥反應。

既往益生菌的研究多集中于腸道，本實驗對其在胃部可能的作用機制作一探討?？紤]到胃部的高酸環(huán)境，小鼠灌胃益生菌前，先予2%NaHCO3溶液0.1 mL，以提高胃部pH值。本研究所用乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌均可在酸性環(huán)境中存活。此外，除外活菌體，益生菌本身的死菌體及其代謝產(chǎn)物亦有競爭性占位、抑制炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等作用。因此，益生菌可定植于胃內(nèi)并發(fā)揮抗H.pylori的療效。

總之，本實驗通過H.pylori感染的C57BL/6小鼠模型探索益生菌根除H.pylori的免疫調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合益生菌治療不僅可提高標準三聯(lián)療法的H.pylori根除率，同時還可減輕小鼠胃黏膜炎癥反應，其機制可能是通過減少Th1細胞應答產(chǎn)生的IL-8、IFN-γ等致炎因子，并誘導Th2細胞應答產(chǎn)生的IL-4、IL-10等抗炎因子，從而減輕黏膜炎癥，增強抗H.pylori的效果。但在治療所用的乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌這三種益生菌中，究竟是哪種益生菌發(fā)揮了主要功效，仍有待進一步研究證實。

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