李建琦 陳 敏 張 松 王 軍 許春紅 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷率低，多數(shù)患者確診時已為進展期胃癌，單純手術(shù)治療常難以根治，化療在綜合治療中發(fā)揮重要作用，可延長患者術(shù)后生存期［1］。然而，諸多因素可導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，從而影響化療效果。ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員介導(dǎo)的藥物外排作用是導(dǎo)致MDR的重要原因，P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥蛋白 1(multidrug resistance protein 1，MRP1)為該家族中與MDR關(guān)系最為密切的兩個重要成員［2，3］。

缺氧和酸化是腫瘤細胞微環(huán)境最主要的特征。腫瘤細胞內(nèi)外存在pH梯度，胞外pH值偏酸性，胞內(nèi)pH值偏中性，與腫瘤細胞的存活、生長、侵襲以及對化療藥物耐藥有關(guān)［4］。腫瘤細胞內(nèi)無氧糖酵解旺盛，產(chǎn)生大量H+，但仍能維持細胞內(nèi)外pH梯度，空泡型質(zhì)子泵(vacuolar H+-ATPases，V-H+-ATPases)在其中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用;腫瘤細胞的空泡型質(zhì)子泵活性極強，在細胞膜和胞內(nèi)酸性囊泡膜上高度表達［5，6］。質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)預(yù)處理能增強腫瘤細胞的化療敏感性，與其抑制空泡型質(zhì)子泵活性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞內(nèi)外pH梯度，顯著增加化療藥物在胞質(zhì)內(nèi)的聚集有關(guān)［7］。因此，PPIs有望作為一種新型化療增敏劑和耐藥逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用于臨床。

已有研究［8］證實PPIs系通過抑制空泡型質(zhì)子泵，逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)外pH梯度而增強胃癌細胞的化療敏感性，本課題組的前期實驗發(fā)現(xiàn)該作用與抑制MDR蛋白P-gp、MRP1表達有關(guān)。胞外酸化環(huán)境可活化胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路［9］，而 PPIs可顯著升高胞外pH值，推測PPIs可能對胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路產(chǎn)生抑制作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)不僅是PI3K/Akt信號通路的下游分子［10］，亦為缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的上游關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子［11］，因此推測PPIs可能通過抑制空泡型質(zhì)子泵，逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)外pH梯度，進而抑制胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路，下調(diào)HIF-1α和MDR蛋白P-gp、MRP1表達，從而提高胞內(nèi)化療藥物濃度，逆轉(zhuǎn)胃癌細胞對化療藥物的MDR。本研究對上述推測進行了驗證。

材料與方法

一、胃癌細胞株、藥物和試劑

人胃腺癌細胞株SGC7901敏感株由南京鼓樓醫(yī)院腫瘤科惠贈，SGC7901多藥耐藥株(SGC7901/MDR)由南京鼓樓醫(yī)院消化科實驗室以阿霉素和順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生。阿霉素對SGC7901和SGC7901/MDR的 IC50分別為(0.654 ±0.103)μg/mL 和(3.203 ±0.302)μg/mL(P ＜0.05)。

注射用埃索美拉唑鈉(阿斯利康制藥有限公司)，注射用泮托拉唑(德國 Nycomed GmbH);LipofectamineTM2000、DAPI、熒光二抗(invitrogenTM，Life Technologies Corporation)，V-H+-ATPases siRNA(Silencer?Select Pre-Designed ＆ Validated siRNA，ambion?，Life Technologies Corporation)，雷帕霉素(LC Laboratories)，V-H+-ATPases抗體 (Abnova Corporation)，P-gp抗體、MRP1抗體、HIF-1α抗體、hamartin(TSC1)抗體、tuberin(TSC2)抗體、Rheb抗體(Abcam plc.)，PI3K p110α 抗體、Akt抗體、mTOR抗體、phospho/TSC2(Ser939)抗體、phospho/TSC2(Thr1462)抗體、phospho-(Ser/Thr)Akt底物抗體(Cell Signaling Technology，Inc.)，山羊抗鼠、山羊抗兔二抗(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng):SGC7901/MDR、SGC7901細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按貼壁方法培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)，SGC7901/MDR細胞培養(yǎng)基內(nèi)含1000 ng/mL阿霉素以維持其MDR表型。

2.PPIs預(yù)處理:取對數(shù)生長中期 SGC7901/MDR、SGC7901細胞，在pH 6.65的未緩沖培養(yǎng)體系中(弱酸環(huán)境可促進PPIs活化)以不同濃度埃索美拉唑或泮托拉唑(0、10、20、50、80、100μg/mL)預(yù)處理24 h，收集細胞。

3.siRNA干擾:取對數(shù)生長中期 SGC7901/MDR細胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按貼壁方法于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，于無血清培養(yǎng)基中加入LipofectamineTM2000和V-H+-ATPases siRNA處理24 h，收集細胞。

4.雷帕霉素阻滯:取對數(shù)生長中期SGC7901/MDR細胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按貼壁方法于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，去除培養(yǎng)基，以不同濃度雷帕霉素(0、20、40、80μg/mL)處理24 h，收集細胞。

5.蛋白質(zhì)印跡法:取上述經(jīng)不同方式處理的細胞，加入預(yù)冷細胞裂解液置冰上裂解30 min，4℃12000 r/min離心(離心半徑7.5 cm)，取上清液行蛋白定量。取30μg總蛋白，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗［V-H+-ATPases、PI3K p110α、Akt、mTOR、HIF-1α、TSC1、TSC2、Rheb、phospho/TSC2(Ser939)、phospho/TSC2(Thr1462)、phospho-(Ser/Thr)Akt底物:1∶1000;P-gp:1∶500;MRP1:1∶50)，4 ℃孵育過夜。以含Tween 20的TBST沖洗，加入山羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育2 h，暗室曝光，掃描圖像，以Quantity One 4.4.0凝膠定量軟件分析目的蛋白相對表達量。

6.免疫熒光法:將經(jīng)高壓滅菌處理的玻片置入6孔板中，取對數(shù)生長中期SGC7901/MDR細胞懸液，以2×105/孔接種于6孔板內(nèi)玻片上，連續(xù)培養(yǎng)24 h，以埃索美拉唑(0、100μg/mL)預(yù)處理 24 h 后取出玻片，PBS漂洗3次，冷丙酮固定，山羊封閉血清室溫封閉1 h，加入V-H+-ATPases一抗(1∶175)或P-gp一抗(1∶75)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。加入熒光二抗(1∶150)室溫孵育 1 h，加入 DAPI(2μg/mL)染核，1 h 內(nèi) DSY5000i倒置熒光顯微鏡(北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司)下觀察、拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、PPIs抑制 SGC7901/MDR細胞內(nèi) V-H+-ATPases和 P-gp、MRP1表達

與對照組(0μg/mL)相比，20μg/mL 埃索美拉唑預(yù)處理24 h可顯著抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的 V-H+-ATPases、P-gp 表達(P ＜0.05)，濃度升至50μg/mL 可顯著抑制 MRP1表達(P ＜0.05)，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P＜0.05)(見圖1A)。然而不同濃度埃索美拉唑預(yù)處理對 SGC7901細胞內(nèi)的 V-H+-ATPases、P-gp、MRP1表達均無明顯影響(見圖1B)。

與對照組相比，10μg/mL泮托拉唑預(yù)處理24 h可顯著抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的V-H+-ATPases表達(P ＜0.05)，濃度升至 20μg/mL 可顯著抑制P-gp、MRP1表達，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P＜0.05)(見圖1C)。

經(jīng)100μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理 24 h的SGC7901/MDR細胞，免疫熒光法檢測顯示胞內(nèi)VH+-ATPases、P-gp表達和定位與對照組相比有明顯改變(見圖2)。

二、PPIs抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路

與對照組相比，20μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理24 h可顯著抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的PI3K、HIF-1α 表達(P ＜0.05)，濃度升至 50μg/mL 可顯著抑制Akt、mTOR 表達(P ＜0.05)，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P＜0.05)(見圖3A)。然而100μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理才能顯著抑制SGC7901細胞內(nèi)的PI3K表達(P＜0.05)，不同濃度埃索美拉唑預(yù)處理對Akt、mTOR、HIF-1α表達均無明顯影響(見圖3B)。

與對照組相比，50μg/mL泮托拉唑預(yù)處理24 h可顯著抑制 SGC7901/MDR細胞內(nèi)的 PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α 表達(P ＜0.05)，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P＜0.05)(見圖3 C)。

三、PPIs對TSC1/2-Rheb信號通路以及Akt底物和TSC2磷酸化的影響

TSC1/2-Rheb信號通路為PI3K/Akt/mTOR信號旁路。與對照組相比，50μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理24 h可顯著抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的TSC1、TSC2、Rheb表達(P ＜0.05)，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P＜0.05)(見圖4A)。然而80μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理才能顯著抑制SGC7901細胞內(nèi)的 TSC2表達(P＜0.05)，且濃度達 100μg/mL時TSC2表達不再繼續(xù)降低;100μg/mL埃索美拉唑預(yù)處理才能顯著抑制TSC1表達(P＜0.05);不同濃度埃索美拉唑預(yù)處理對Rheb表達均無明顯影響(見圖4B)。

Akt底物的磷酸化水平可直接反映Akt磷酸化調(diào)節(jié)的作用強度，埃索美拉唑和泮托拉唑預(yù)處理24 h均可呈濃度依賴性地抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的Akt底物磷酸化;Ser939、Thr1462是 Akt磷酸化TSC2的兩個重要位點，埃索美拉唑和泮托拉唑預(yù)處理24 h均能在一定程度上抑制這兩個位點的磷酸化(見圖5)。

圖1 PPIs預(yù)處理對SGC7901/MDR、SGC7901細胞內(nèi)V-H+-ATPases和P-gp、MRP1表達的影響

圖2 埃索美拉唑預(yù)處理對SGC7901/MDR細胞內(nèi)V-H+-ATPases、P-gp表達和定位的影響(×200)

圖3 PPIs預(yù)處理對SGC7901/MDR、SGC7901細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路的影響

圖4 PPIs預(yù)處理對SGC7901/MDR、SGC7901細胞內(nèi)TSC1/2-Rheb信號通路的影響

四、PPIs對SGC7901/MDR細胞內(nèi)TSC1/2復(fù)合物表達的影響呈時間依賴性

TSC1、TSC2為抑癌基因，然而PPIs可呈濃度依賴性地抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的TSC1/2復(fù)合物表達，為此本實驗進一步在未緩沖培養(yǎng)體系中以80μg/mL埃索美拉唑分別預(yù)處理SGC7901/MDR細胞 15 min 和3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，結(jié)果顯示埃索美拉唑?qū)Π麅?nèi)TSC1/2復(fù)合物表達的影響呈時間依賴性，處理 3 h后 TSC1、TSC2表達較對照組(15 min)顯著升高(P＜0.05)，18 h后與對照組相比無明顯差異，24 h后較對照組顯著降低(P＜0.05);TSC1表達于處理12 h后達峰值，TSC2表達處理6 h后即達峰值(見圖6)。

圖5 PPIs預(yù)處理對SGC7901/MDR細胞內(nèi)Akt底物和TSC2磷酸化的影響

圖6 埃索美拉唑預(yù)處理對SGC7901/MDR細胞內(nèi)TSC1/2復(fù)合物表達的影響

五、V-H+-ATPases siRNA抑制 SGC7901/MDR細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路和P-gp表達

V-H+-ATPases siRNA干擾可明顯抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的 V-H+-ATPases表達(見圖 7A)，PI3K、Akt、TSC1、TSC2、mTOR、HIF-1α、P-gp 表達隨之顯著下調(diào)(P＜0.05)(見圖7B)，與PPIs預(yù)處理結(jié)果相似。

六、雷帕霉素阻斷mTOR抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi) HIF-1α、P-gp表達

與對照組相比，20μg/mL雷帕霉素處理24 h可顯著抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的mTOR表達(P＜0.05)，抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，呈濃度依賴性(P ＜0.05)，濃度升至80μg/mL 時，mTOR表達幾乎完全被抑制;HIF-1α、P-gp表達隨mTOR表達的下降同步降低(P＜0.05)(見圖8)。

圖7 V-H+-ATPases siRNA對SGC7901/MDR細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路和 P-gp表達的影響

圖8 雷帕霉素阻斷mTOR對SGC7901/MDR細胞內(nèi)HIF-1α、P-gp表達的影響

討 論

腫瘤細胞的MDR是一個復(fù)雜的多因素現(xiàn)象，與其局部微環(huán)境如缺氧、酸化、炎癥以及腫瘤細胞本身密切相關(guān)［12］。為闡明腫瘤發(fā)生的生物學(xué)機制，尋找更好的治療途徑，近年來腫瘤細胞代謝及其微環(huán)境重新成為研究熱點。腫瘤細胞處于一種缺氧、酸化的微環(huán)境中，細胞內(nèi)外存在pH梯度，可激活細胞內(nèi)部一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，導(dǎo)致化療耐藥［13］?？张菪唾|(zhì)子泵對腫瘤細胞內(nèi)外pH梯度的維持起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，PPIs則可抑制空泡型質(zhì)子泵活性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞內(nèi)外pH梯度，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值偏酸性，胞外pH值偏堿性，并增強胃癌細胞的化療敏感性［8］。本課題組的前期實驗發(fā)現(xiàn)PPIs增強胃癌細胞化療敏感性的作用與抑制 MDR蛋白P-gp、MRP1表達有關(guān)。本實驗證實PPIs可呈濃度依賴性地抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的空泡型質(zhì)子泵表達，同時抑制P-gp、MRP1表達，對SGC7901細胞內(nèi)的上述蛋白表達則無明顯影響，證實PPIs可通過抑制空泡型質(zhì)子泵下調(diào)MDR蛋白表達并改變其胞內(nèi)定位，從而提高耐藥胃癌細胞的化療敏感性。

PI3K/Akt信號通路可調(diào)節(jié)細胞生長、增殖，促進細胞骨架形成。TSC1、TSC2為抑癌基因，位于Akt下游、mTOR上游，是PI3K/Akt信號通路的重要調(diào)控位點。這兩種基因產(chǎn)物形成的復(fù)合物TSC1/2對Rheb(一種大量存在于腦組織中的Ras超家族GTP結(jié)合蛋白)具有GAP(GTP酶活化蛋白)活性，是mTOR的關(guān)鍵負性調(diào)節(jié)因子。Akt激活后磷酸化TSC2的Ser939和Thr1462兩個位點，導(dǎo)致TSC1/2復(fù)合物解離，對Rheb的抑制作用解除，從而活化下游 mTOR 分子，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［14～16］。mTOR 不僅是PI3K/Akt信號通路的下游分子，亦為HIF-1α的上游關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子［10，11］。

本實驗發(fā)現(xiàn)PPIs可呈濃度依賴性地抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的PI3K、Akt及其下游分子mTOR、HIF-1α表達以及Akt底物磷酸化，表明PPIs可抑制耐藥胃癌細胞內(nèi)的PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路，然而本實驗未能進一步檢測PI3K/Akt信號通路中其他中間信號分子的表達情況以及Akt自身的磷酸化狀態(tài)。后續(xù)研究擬完善上述不足，并在應(yīng)用PPIs的同時或其后上調(diào)PI3K/Akt信號通路，如HIF-1α和MDR蛋白表達不受影響，則更能說明PPIs的作用依賴于該通路。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)PPIs引起的PI3K/Akt信號通路抑制使TSC2磷酸化水平降低，導(dǎo)致TSC1/TSC2復(fù)合物表達及其GAP活性在一定時間段內(nèi)上調(diào)，從而抑制Rheb的表達和活性及其下游mTOR分子。表明PPIs還可抑制PI3K/Akt/mTOR信號旁路，通過抑制TSC1/2-Rheb信號通路以抑制其下游mTOR分子而發(fā)揮作用。

PPIs對TSC1/2復(fù)合物表達的影響呈時間依賴性，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路的調(diào)控可能存在某種負反饋回路。已有研究證實PI3K/Akt信號通路的下游組分如mTOR可通過抑制胰島素受體底物蛋白(IRS)功能而阻斷該信號通路的進一步活化［17］。由此推測mTOR表達抑制可能反饋性地促進該信號通路活化，進而抑制TSC1/2復(fù)合物表達，具體機制有待進一步研究。

空泡型質(zhì)子泵高表達于腫瘤細胞的細胞膜和胞內(nèi)酸性囊泡膜，正常組織細胞膜不表達空泡型質(zhì)子泵，其主要功能為將腫瘤細胞胞質(zhì)中糖酵解產(chǎn)生的H+泵出胞外或泵入胞內(nèi)酸性囊泡，以維持胞質(zhì)內(nèi)弱堿性或偏中性的環(huán)境，此環(huán)境與腫瘤細胞對化療藥物耐藥密切相關(guān)。本研究以V-H+-ATPases siRNA抑制SGC7901/MDR細胞內(nèi)的V-H+-ATPases表達后，PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路及其旁路分子表達均受抑，MDR蛋白P-gp表達下調(diào)，證實了空泡型質(zhì)子泵在胃癌細胞化療耐藥機制中的重要地位，表明PPIs系通過抑制空泡型質(zhì)子泵，逆轉(zhuǎn)耐藥胃癌細胞的胞內(nèi)外pH梯度而發(fā)揮作用。

mTOR對天然化合物雷帕霉素非常敏感，雷帕霉素對mTOR的抑制作用有極強的特異性［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可呈濃度依賴性地抑制mTOR表達，下游HIF-1α、P-gp表達同步降低，雷帕霉素濃度升至80μg/mL時，mTOR表達幾乎完全被抑制，HIF-1α、P-gp表達亦如是，證實兩者位于mTOR分子下游，表明PPIs系通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而抑制HIF-1α和MDR蛋白表達以增強耐藥胃癌細胞的化療敏感性。有研究［18］發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過調(diào)節(jié)p53和NF-κB決定胃癌細胞的化療敏感性，抑制HIF-1α可使胃癌細胞對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性顯著增強。表明抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可通過不同途徑逆轉(zhuǎn)胃癌細胞對化療藥物的 MDR，包括調(diào)節(jié) p53、NF-κB以及下調(diào)MDR蛋白等。關(guān)于HIF-1α能否通過MDR蛋白參與腫瘤細胞的MDR及其在非缺氧條件下的耐藥機制，均有待進一步研究。

綜上所述，PPIs可通過抑制耐藥胃癌細胞的胞內(nèi)空泡型質(zhì)子泵逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞內(nèi)外pH梯度，使腫瘤細胞胞內(nèi)酸化、胞外堿化，從而改變腫瘤細胞微環(huán)境，同時抑制胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而抑制HIF-1α和MDR蛋白表達，以增強腫瘤細胞的化療敏感性，逆轉(zhuǎn)其對化療藥物的MDR。PPIs有望成為一種新型腫瘤化療佐劑，但目前研究尚處于細胞和動物水平，相關(guān)臨床試驗仍有待開展。

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