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      油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立

      2012-05-22 07:17:19趙萬千史團省沙琰琰張志杰
      關(guān)鍵詞:卡那霉素共培養(yǎng)外植體

      劉 品, 趙萬千, 史團省, 沙琰琰, 張志杰, 朱 墨

      (鄭州大學(xué) 生物工程系 生物多樣性與生態(tài)學(xué)研究所 河南 鄭州 450001)

      0 引言

      通過基因工程手段改良油菜的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性,建立良好的油菜轉(zhuǎn)化體系至關(guān)重要.油菜的遺傳轉(zhuǎn)化始于20世紀(jì)80年代后期,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)培育出抗病[1]、抗蟲、抗除草劑及品質(zhì)改良[2]的轉(zhuǎn)基因材料.

      2004年文獻(xiàn)[3]第一次克隆了WIN1基因,目的是通過基因工程技術(shù)將SHN1/WIN1基因插入甘藍(lán)型油菜中油821,使其角質(zhì)膜厚度和成分有所改變,主要是防止自身體內(nèi)水分過度蒸騰散失,保持體內(nèi)水分的平衡[4-5],以此來提高油菜的抗旱、抗寒和抗病等性能,為提高油菜抗逆性,特別是為抗旱和抗寒性育種奠定基礎(chǔ).該項研究不僅對認(rèn)識和揭示植物角質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)功能具有重要理論意義,而且對應(yīng)用植物基因工程技術(shù)改良和培育抗逆性強的作物優(yōu)良品種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都具有重要的應(yīng)用價值[6-7].

      本研究以甘藍(lán)型油菜中油821為實驗材料,對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行了探討,采用根癌農(nóng)桿菌方法將控制角質(zhì)膜厚度和成分的SHN1/WIN1基因轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜中,目的是防止油菜自身體內(nèi)水分過度蒸騰散失,保持體內(nèi)水分的平衡,提高油菜抗旱、抗寒和抗病能力,提高油菜抗逆性.

      1 材料和方法

      1.1 材料

      1.1.1植物材料 試驗材料為甘藍(lán)型油菜中油821,種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所饋贈.播種出苗后,取苗齡為4~5 d的無菌葉柄作為轉(zhuǎn)化外植體.

      1.1.2菌株和質(zhì)粒 植物表達(dá)載體PBI121-SHN1/WIN1和根癌農(nóng)桿菌均由鄭州大學(xué)生物工程系植物生理與營養(yǎng)實驗室構(gòu)建和保存.植物表達(dá)載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因[8].

      1.1.3培養(yǎng)基 試驗所用培養(yǎng)基主要有以下幾種:

      YEB培養(yǎng)基:牛肉膏(5 g/L),酵母抽提物(1 g/L),蛋白胨(5 g/L),蔗糖(5 g/L),MgSO4(2 mmol/L),pH 7.2,固體培養(yǎng)基含瓊脂15 g/L.

      重懸培養(yǎng)基:1/2(MS)+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS).

      基本培養(yǎng)基:MS+0.7%瓊脂,pH 5.8.

      共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS),pH 5.8.

      濾菌培養(yǎng)基:MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car),pH 5.8.

      分化篩選培養(yǎng)基:MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car)+Kan ,pH 5.8.

      生根培養(yǎng)基:MS+0.2 mg/L(NAA)+400 mg/L(Car)+Kan, pH 6.0.

      所有培養(yǎng)基如沒有特殊說明,均為121 ℃條件下,高溫高壓滅菌20 min,現(xiàn)用現(xiàn)配.

      瓊脂、蛋白胨、酵母提取物和抗生素均為Solarbio分裝,其他生化試劑和常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

      1.2 方法

      1.2.1無菌苗的獲得

      (1) 首先進(jìn)行種子消毒,選取籽粒飽滿、大小均一的油菜種子放于三角瓶內(nèi),用0.1% HgCl2消毒7 min,無菌水清洗4次,用滅過菌的吸水紙將水分吸干;

      (2) 將滅好菌的種子均勻擺放在基本培養(yǎng)基上,封好瓶口,置于28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng),待萌發(fā)后取其生長5 d的子葉柄做為實驗材料.

      1.2.2農(nóng)桿菌培養(yǎng)

      (1) 挑取攜帶植物表達(dá)載體質(zhì)粒PBI121-SHN1/WIN1的農(nóng)桿菌單菌落,接種在10 ml含40 mg/L Str和100 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃和200 rpm環(huán)境中振蕩培養(yǎng)過夜.

      (2)活化過夜的農(nóng)桿菌按1∶100(V∶V)的比例接種在相同的YEB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)直到OD600為0.4.

      (3)用12 000 rpm離心5 min,收集菌體,用重懸培養(yǎng)基同體積重懸使用.

      1.2.3外植體的侵染及共培養(yǎng)

      在超凈工作臺中打開瓶蓋,用解剖刀將苗切下放到滅過菌的培養(yǎng)皿中,加入少量無菌水,防止時間過長幼苗失水影響再生活性.再用解剖刀將下胚軸和子葉柄切下,下胚軸長度約0.5~1 cm,子葉柄切口應(yīng)盡量靠近生長點,且要除去生長點.切完后移入另一培養(yǎng)皿中,用重懸好的菌液侵染5 min.

      (1)共培養(yǎng):吸水紙吸干表面菌液,隨后將子葉柄均勻擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)3 d.

      (2)濾菌培養(yǎng):將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到濾菌培養(yǎng)基上,在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)3~7 d.

      (3)分化篩選培養(yǎng):將外植體濾菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上,在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)21 d左右,外植體表面開始出現(xiàn)白色愈傷組織,之后長出大量綠色小芽或者白化苗.

      (4)繼代培養(yǎng):將長出大量愈傷組織的抗性外植體分割成小塊后轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基,此時的篩選壓力為14 mg/L.

      (5)生根培養(yǎng):待篩選的抗性芽長至3~5 cm時,切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根,獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因油菜植株.7~10 d后傷口處有根長出,40 d左右形成根系,經(jīng)一周煉苗,即可進(jìn)行移栽.

      1.2.4培養(yǎng)條件對轉(zhuǎn)化的影響

      所有組織培養(yǎng)過程,若無特別說明,都是在28 ℃、16 h光照/8 h黑暗光周期、光照強度為1 600~ 2 000 Lx的光照培養(yǎng)室中進(jìn)行.農(nóng)桿菌平板的培養(yǎng)是在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,預(yù)活化及其活化均在28 ℃、200 rpm的恒溫?fù)u床上進(jìn)行.

      2 結(jié)果和分析

      2.1 卡那霉素濃度對帶柄子葉分化的影響

      植物表達(dá)載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因,為了確定外植體對卡那霉素的臨界值,將未侵染菌液的預(yù)培養(yǎng)帶柄子葉置入不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基,每個梯度3個重復(fù),進(jìn)行敏感度實驗,其結(jié)果見表1.由表1可知,帶柄子葉對卡那霉素較為敏感,當(dāng)卡那霉素濃度為9 mg/L時,比未加Kan的對照(CK)減少了將近53.34%;當(dāng)卡那霉素濃度為11 mg/L時,芽的誘導(dǎo)率明顯下降,且分化苗幾乎為白化苗,因此將卡那霉素篩選濃度初步定為11 mg/L.由此說明,隨著Kan濃度的提高,其選擇壓力增強,即Kan濃度越高,逃脫選擇的綠芽減少且對芽的再生有強烈的抑制作用.

      2.2 菌液濃度與侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響

      在油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中,適宜的農(nóng)桿菌感染濃度和侵染時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的重要因素.表2和表3表明,當(dāng)OD600值為0.4時,侵染5 min卡那霉素分化苗最高,隨著菌液濃度的升高(OD600>0.4),侵染時間越長,外植體被侵染越厲害,致使外植體切口部位變黑、腐爛,甚至大量褐化死亡.研究表明,農(nóng)桿菌對外植體的侵染時間過短,菌液濃度偏低,導(dǎo)致受體細(xì)胞未被侵染,使假陽性再生芽增多.

      表1 外植體對卡那霉素的敏感度實驗Tab.1 Sensitivity of explants to kannmycin

      注:/表示無,+表示少

      表2 菌液濃度對轉(zhuǎn)化的影響Tab.2 Effects of bacterium concentration on transformation

      注:/表示無,+表示少,++表示一般,+++表示多;后面表格同樣表示

      2.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

      根癌農(nóng)桿菌的粘附、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合過程都在共培養(yǎng)時期,共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要環(huán)節(jié),掌握好合適的共培養(yǎng)時間和方法非常重要.由表4可以看出,外植體共培養(yǎng)24 h后,開始有抗性芽的出現(xiàn),不過頻率很低;當(dāng)共培養(yǎng)48 h時,外植體的轉(zhuǎn)化率已明顯提高;但是共培養(yǎng)時間超過72 h后,不定芽的分化頻率不斷下降,農(nóng)桿菌泛濫嚴(yán)重,褐化死亡的外植體也急劇增加;到共培養(yǎng)96 h后,外植體幾乎全部死亡.上述結(jié)果表明,共培養(yǎng)時間為48 h時,轉(zhuǎn)化率最高,可定為本實驗所用油菜品種的最適共培養(yǎng)時間.

      表3 菌液侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響Tab.3 Effects of bacterium immerged time on transformation

      表4 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效果的影晌Tab.4 Effect of cocultivation time on transformation frequency

      2.4 乙酰丁香酮(AS)對轉(zhuǎn)化的影響

      農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),宿主植物細(xì)胞能分泌某些酚類化合物,可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)的活化和高效表達(dá),促進(jìn)農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率.其中常用且誘導(dǎo)效果最佳的是乙酰丁香酮(AS),AS作為誘導(dǎo)性最好的酚類化合物,被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化中,取得了較好的效果,使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法更加完善.原理是誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化,從而促進(jìn)外源基因的整合.所以最好讓其有一定的誘導(dǎo)時間再轉(zhuǎn)化,而不是加完后直接轉(zhuǎn)化(活化需要一段時間),就是在重懸培養(yǎng)基中和共培養(yǎng)基中都加入AS,濃度為200 μmol/L,效果會更好.說明AS可提高油菜的再生頻率及轉(zhuǎn)化率,這與藍(lán)海燕[9]等人的研究結(jié)果一致.

      2.5 AgNO3對轉(zhuǎn)化的影響

      在封閉的培養(yǎng)容器中,植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生乙烯,造成乙烯的過量積累,從而影響外植體的生長和分化芽的產(chǎn)生.加入AgNO3,一方面可以抑制乙烯的活性,促進(jìn)植物器官和體細(xì)胞胚胎的發(fā)生;另一方面,還具有降低玻璃苗的產(chǎn)生概率和抑制外植體褐化等功能,從而提高油菜的再生率和遺傳轉(zhuǎn)化率.本試驗發(fā)現(xiàn),添加一定量的AgNO3(濃度為5~10 mg/L),可促進(jìn)芽的再生,大大降低外植體褐化的現(xiàn)象[10],也不會對外植體產(chǎn)生負(fù)作用.

      3 結(jié)論與討論

      農(nóng)桿菌介導(dǎo)是油菜轉(zhuǎn)化最常用的一種方法.在轉(zhuǎn)化過程中,許多因素都對轉(zhuǎn)化效果有一定的影響,包括植物的基因型、所采用的外植體及其狀態(tài)、培養(yǎng)條件和選擇方法等.本研究可得出如下結(jié)論:

      (1)使用5 d苗齡的帶柄子葉作為轉(zhuǎn)化受體,具有再生率高、再生周期短以及對農(nóng)桿菌敏感等特點,這一實驗結(jié)果與梁會娟[11]等人研究相符.

      (2)卡那霉素的篩選濃度非常重要,確定11 mg/L為該實驗篩選的臨界濃度.只有確定卡那霉素的臨界值,才能降低再生苗的假陽性率,減少后續(xù)抗性苗篩選的工作量,方便篩選工作的順利進(jìn)行.因此在整個的篩選轉(zhuǎn)化體系中,前期篩選應(yīng)采用較低濃度的抗生素,待芽長出后再用高濃度的抗生素篩選,這樣可以避免剔除轉(zhuǎn)基因綠苗,從而大大提高轉(zhuǎn)化效率[12-13].

      (3)侵染時間為5 min時,其外植體轉(zhuǎn)化率最高.通過菌液濃度與侵染時間對外植體的實驗,表明菌液濃度OD600值為0.4時,轉(zhuǎn)化率最高,這與何業(yè)華[14]等人研究結(jié)果相似,褐化程度較弱.

      (4)共培養(yǎng)時間的長短在很大程度上影響著轉(zhuǎn)化率.試驗表明,共培養(yǎng)時間為48 h時效果最好,不僅有利于外源基因的整合,也不會造成農(nóng)桿菌的過度增殖.

      (5)在培養(yǎng)基中添加AgNO3,不僅可以防止褐化,而且能夠提高轉(zhuǎn)化率;在重懸培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS可明顯提高轉(zhuǎn)化效率.

      參考文獻(xiàn):

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      [2] 張鵬,傅愛根,王愛國.AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機制[J].植物生理學(xué)通報1997,33(5):376-379.

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