席 宇， 吉彥龍， 李敏睿， 曹瑞麗， 王燕燕， 朱大恒

(鄭州大學(xué) 生物工程系 河南 鄭州 450001)

0 引言

煙梗是卷煙工業(yè)的廢棄物，約占煙葉總重20%～ 30%[1-2].煙梗中含有大量的糖類和氮類物質(zhì)[3-4].目前廢棄煙梗多用來提取煙堿、果膠、煙酸，茄尼醇[5-6]或者用于堆肥[1].在煙草加工和煙草廢棄物處理過程中常產(chǎn)生大量的煙草廢水(TWW)，TWW中含有大量有機(jī)物質(zhì)[7-10]，因此在TWW的處理前或處理過程中對其進(jìn)行資源化利用是非常重要的.利用酵母菌將工農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為單細(xì)胞蛋白已引起科研工作者的極大興趣[11-15].紅酵母富含氨基酸、維生素及類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質(zhì), 是天然色素源、極具潛力的飼料蛋白和食品添加劑, 具有很高應(yīng)用價值[16-20].利用TWW發(fā)酵生產(chǎn)紅酵母尚未見報道.本文從廢棄煙梗的初期固態(tài)發(fā)酵物中篩選到一株紅酵母，在對其進(jìn)行培養(yǎng)、形態(tài)和生理生化特征研究基礎(chǔ)上，初步鑒定為一株深紅酵母，探討了以其發(fā)酵TWW生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的潛力.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TWW來源于廢棄煙梗的固態(tài)發(fā)酵前的浸泡過程.廢棄煙梗由河南天昌煙草國際有限公司提供,直徑為0.15～ 0.50 cm, 長度為0.2～ 5.0 cm.β-類胡蘿卜素標(biāo)品購自Fluka公司(>97.0%)，其余所有供試藥品和試劑均為分析純.

1.2 煙草廢水的預(yù)處理及成分分析

TWW于8 000 rpm離心5 min，上清液用于制備TWW培養(yǎng)基.TWW主要成分分析采用連續(xù)流動分析儀(AA3，德國)，pH值采用精密pH計(PHS-3C，上海精密儀器有限公司)進(jìn)行測量.

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)采用酵母粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)：1% 酵母粉(質(zhì)量濃度)，2%蛋白胨(質(zhì)量濃度)，2%葡萄糖(質(zhì)量濃度).篩選和發(fā)酵采用TWW培養(yǎng)基，配方為預(yù)處理TWW，其中固體培養(yǎng)基瓊脂含量均為1.5%，菌種保藏和活化采用TWW斜面培養(yǎng)基.培養(yǎng)基滅菌條件為115 ℃滅菌20 min.

1.4 菌株分離鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)

1.4.1菌株篩選

從廢棄煙梗初期固態(tài)發(fā)酵物[1]中取樣5 g接種于裝有50 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的250 mL 三角瓶中, 振蕩30 min后靜置片刻,取5 mL 懸浮液接種于30 mL含0.25%丙酸鈉的YPD培養(yǎng)液, 28 ℃和180 rpm富集培養(yǎng)48 h，取0.2 mL富集培養(yǎng)液涂布于TWW篩選平板上, 28 ℃培養(yǎng)3 d,定期觀察.挑選紅色、粉紅色、橙紅色且生長迅速的菌落進(jìn)行分離純化.根據(jù)形態(tài)特征初步確定為酵母菌后接種于TWW斜面培養(yǎng)基, 4 ℃保存?zhèn)溆?本實驗的液體培養(yǎng)條件均為28 ℃和180 rpm.

1.4.2分離菌株的鑒定

分離酵母菌的鑒定采用形態(tài)觀察和生理生化特征分析相結(jié)合的方法進(jìn)行.

1.4.3菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

挑取一環(huán)斜面保藏的培養(yǎng)物，接種于30 mL的TWW液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，以體積濃度5%的接種量加入到50 mL的TWW培養(yǎng)液中同條件培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞產(chǎn)量和色素含量分析.

分別在TWW中加入質(zhì)量濃度0.8%蔗糖、酵母粉、蛋白胨、NaH2PO4、NH4Cl和(NH4)2SO4來考察6種因子的添加對菌株JLC細(xì)胞產(chǎn)量和色素含量的影響，接種方法和培養(yǎng)條件同上.

1.5 測定方法

1.5.1生物量測定

取30 mL發(fā)酵液，4 000 rpm離心10 min，收集菌體，自來水洗滌2次，60 ℃烘至恒重后稱重.

1.5.2類胡蘿卜素的提取與測定

類胡蘿卜素的提取按文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行，干菌體經(jīng)鹽酸-熱處理破壁后，以丙酮抽提類胡蘿卜素.用紫外可見分光光度計在350～ 600 nm 波長掃描類胡蘿卜素丙酮浸提液，找出最高吸收波長.將提取液適當(dāng)稀釋后,測定最高吸收波長處吸光度, 計算類胡蘿卜素含量

式中,Aλmax為色素最大吸收波長處的吸光度,D為測定試樣的稀釋倍數(shù),V為提取色素所用溶劑量(mL)，W為菌體重量(g), 0.16為類胡蘿卜素的消光系數(shù).

類胡蘿卜素產(chǎn)量的計算：類胡蘿卜素產(chǎn)量(mg/L)=色素含量×細(xì)胞產(chǎn)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草廢水主要特征

TWW中含有大量有機(jī)物質(zhì)，主要包括可溶性多糖、煙堿、酚類和氮等，其主要特征如表1.TWW的pH值為5.3～5.6，因此TWW的營養(yǎng)和理化條件符合酵母菌對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的要求.

表1 TWW主要成分分析Tab.1 The major characteristics analysis of TWW

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1培養(yǎng)和形態(tài)特征

經(jīng)過富集培養(yǎng)和劃線分離，從TWW平板中篩選出一株生長良好的酵母菌，命名為JLC.JLC在YPD培養(yǎng)基上菌落較大，表面光滑、隆起、粘稠濕潤、不透明，橙紅色，邊緣整齊(圖1a).顯微鏡檢表明細(xì)胞多為球形或橢圓形，出芽生殖(如圖1b).

2.2.2生理生化特征

菌株JLC的主要生理生化特征見表2.菌株JLC能夠同化碳源海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、棉籽糖和木糖；不能同化碳源密二糖、D-氨基葡萄糖、2-酮基-葡萄糖酸鹽、赤蘚醇、纖維二糖、鼠李糖、乳酸、肌醇、甘露醇，山梨醇和甘油等；不能夠利用硝酸鹽，不耐受放線菌酮.結(jié)合形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化特征，參考文獻(xiàn)初步鑒定JLC為一株深紅酵母(Rhodotorularubra).

圖1 菌株JLC的菌落和菌體特征Fig.1 The colony and microscopic characters of JLC in YPD medium

生理生化反應(yīng)結(jié)果生理生化反應(yīng)結(jié)果2-酮基-葡萄糖酸鹽-半乳糖+乳酸-纖維二糖-密二糖-棉籽糖+肌醇-山梨醇-海藻糖+松三糖-麥芽糖+鼠李糖-D-氨基葡萄糖-D-葡萄糖苷-赤蘚醇-甘油-阿拉伯糖+木糖+甘露醇-硝酸鹽-蔗糖+放線菌酮耐受試驗-

注：+ 表示生長；- 表示不生長

2.3 不同添加物對篩選菌株的生物量的影響

TWW中含有尼古丁，對微生物的生長具有抑制作用[9]，但菌株JLC在TWW中生長迅速，不同的添加物對JLC的生物量有顯著影響，從圖2可看出，在TWW培養(yǎng)液中，細(xì)胞干重可達(dá)9.37 g/L.蔗糖、蛋白胨、酵母粉和NaH2PO4的添加能夠提高生物量，當(dāng)添加NaH2PO4時，細(xì)胞干重可達(dá)到14.87 g/L；添加NH4Cl和(NH4)2SO4生物量稍微下降.這可能由于TWW不缺乏氮源或者無機(jī)氮源不適合酵母菌生長造成的.

2.4 篩選菌株的色素特征及測定

菌株JLC色素的丙酮抽提液與β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收掃描圖譜相比, 其最大吸收峰有偏離(圖3).β-類胡蘿卜素標(biāo)品最大吸收波長在450 nm, 菌株JLC的色素最高吸收波長在485 nm，具有類胡蘿卜素的典型雙肩峰特征，這與報道深紅酵母的類胡蘿卜素最大吸收波長相一致[20].

圖2 不同添加物對JLC細(xì)胞產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different additives on cell biomass of JLC

圖3 β-類胡蘿卜素和菌株JLC色素的掃描光譜比較Fig.3 UV-visible spectra of β-carotenoids and pigments extracted from strain JLC

對JLC色素含量和產(chǎn)量進(jìn)行考察，結(jié)果如表3，在TWW中色素含量為200.52 μg/g，不同添加物對細(xì)胞色素含量有不同影響.除NaH2PO4外，其他添加物都導(dǎo)致細(xì)胞中色素含量降低.雖然色素含量略低，由于生物量提高，添加蔗糖、酵母粉、蛋白胨和NaH2PO4的TWW中色素產(chǎn)量均提高，最大為3.04 mg/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量相對較高[17-18].類胡蘿卜素的合成與菌體的生長周期有關(guān)，營養(yǎng)物添加可能影響細(xì)胞的生長周期和色素的形成時間，培養(yǎng)時間的增加能提高色素的含量和產(chǎn)量.為獲得大量的菌體或色素，發(fā)酵培養(yǎng)中需要進(jìn)一步延長培養(yǎng)時間，優(yōu)化培養(yǎng)條件.

3 結(jié)論

通過對菌株JLC的初步研究，可得出如下結(jié)論：

(1)從煙草廢棄物中分離出一株酵母菌JLC，鑒定為深紅酵母，菌株JLC可在TWW中生長，5%的接種量28 ℃培養(yǎng)4 d, 細(xì)胞干重可達(dá)9.37 g/L；

(2)向TWW中添加營養(yǎng)物質(zhì)可提高菌株JLC的生物量，其中添加0.8%的NaH2PO4可顯著提高生物量，5%的接種量，28 ℃培養(yǎng)4 d,細(xì)胞干重可達(dá)14.87 g/L；

(3)菌株JLC富含類胡蘿卜素，其色素最高吸收峰在485 nm，初步實驗最大色素含量為204.77 μg/g,最大色素產(chǎn)量為3.04 mg/L.

表3 不同添加物對菌株JLC色素含量和產(chǎn)量的影響Tab.3 Effect of different additives on carotenoid content and yield of strain JLC

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