李海濤 杜玉麗 張子君 曲 彤 鄒慶道

（1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是一種世界性經(jīng)濟(jì)作物，品種多，產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，用途廣泛。限制番茄生產(chǎn)發(fā)展和產(chǎn)量的主要原因在于病害的流行為害和逆境條件的制約（葉青靜 等，2009）。病毒病是番茄生產(chǎn)中最常見(jiàn)、發(fā)病最普遍的病害之一，其中的番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD）是近年發(fā)生的一種暴發(fā)性、毀滅性病害，一旦發(fā)病，很難控制。番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）于1939～1940年在以色列首次發(fā)現(xiàn)（Pico et al.，1996），是一類(lèi)由煙粉虱介導(dǎo)傳播的雙生病毒（geminiviruses），該病毒為雙生病毒科（Geminniviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begonurvints）成員（周雪平 等，2003）。番茄生長(zhǎng)發(fā)育早期感染 TYLCV，其癥狀主要表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)緩慢或停滯，節(jié)間縮短，植株矮化，上部葉片變小、變厚、有褶皺、向上卷曲、變形、葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化，無(wú)法正常開(kāi)花結(jié)果，下部葉片癥狀不明顯；后期感染TYLCV，染病植株僅上部葉片和新芽表現(xiàn)癥狀，坐果困難，果實(shí)僵化不膨大，或膨大速度極慢，果實(shí)變小，畸形果多，成熟期果實(shí)不能正常轉(zhuǎn)色、失去商品價(jià)值，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。目前在中東地區(qū)、非洲、亞洲、歐洲、美洲等世界各地都有發(fā)生并且已給美國(guó)、以色列、埃及、澳大利亞等國(guó)的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，我國(guó)廣東、廣西、臺(tái)灣、上海、江蘇等地都有發(fā)生的報(bào)道（何自福 等，2007；趙統(tǒng)敏 等，2007），并呈現(xiàn)由南向北迅速蔓延的趨勢(shì)，已經(jīng)成為影響番茄生產(chǎn)的主要限制因素之一。

目前番茄黃化曲葉病毒病的抗病基因有 Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、TY-5等，研究較多的是Ty-1、Ty-2、Ty-3基因。Zamir等（1994）認(rèn)為T(mén)y-1基因?yàn)橹餍Щ颍摶驗(yàn)椴煌耆@性單基因，并將其定位在番茄第6號(hào)染色體的RFLP標(biāo)記TG297（4 cM）和TG97（8.6 cM）之間，圖距6～10 cM。番茄黃化曲葉病毒病屬檢疫性病害，利用常規(guī)方法進(jìn)行抗病育種有較大困難，利用分子標(biāo)記結(jié)合常規(guī)方法能高效、準(zhǔn)確地進(jìn)行抗病材料的篩選與鑒定。本試驗(yàn)旨在尋找與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1緊密連鎖的分子標(biāo)記，并利用該標(biāo)記進(jìn)行抗病材料的檢測(cè)，為分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)共用番茄材料63份。其中含抗病基因Ty-1的純合材料3份，編號(hào)為CK1、CK2、CK3，基因型為T(mén)y-1/Ty-1，來(lái)自亞蔬中心（AVRDC）；不含抗病基因Ty-1的感病純合材料3份，編號(hào)為CK4（L402母本）、CK5（L402父本）、CK6（金棚1號(hào)母本），基因型為ty-1/ty-1，來(lái)自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組。

抗病的F18份，編號(hào)為7～14，來(lái)自上海種都種業(yè)科技有限公司，在2010年召開(kāi)的“全國(guó)抗番茄黃化曲葉病毒病品種展示會(huì)”上表現(xiàn)為抗病。7號(hào)為迪達(dá)，8號(hào)為迪瑞，9號(hào)為T(mén)Y4220，10號(hào)為迪維斯，11號(hào)為T(mén)Y4378，12號(hào)為T(mén)Y4430，13號(hào)為T(mén)Y1415，14號(hào)為T(mén)Y3175；未知抗病性的F125份，編號(hào)為 15～39，來(lái)自國(guó)外種子公司，具體名稱不祥。未知抗病性的自交系材料24份，編號(hào)為40～63，來(lái)自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 番茄抗黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1的CAPS標(biāo)記引物參照Z(yǔ)amir等（1994）的方法設(shè)計(jì)。引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成。材料的特異性引物序列及其擴(kuò)增片斷見(jiàn)表1。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及酶切體系 DNA提取參照Williamson等（1994）的方法，由CTAB法提取。用于PCR反應(yīng)和酶切的藥品均購(gòu)自tiangen生物工程公司。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括：模板DNA 20 ng，dNTP 0.4 μL，引物（10 U）各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.5 μL，Buffer 2.0μL，Mg2+2.0μL，終體積用超純水加至20 μL。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，64.6 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。酶切體系為擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL加入10 U的Rsa I 酶1 μL，Buffer 2 μL，終體積用超純水加至20 μL。37 ℃保溫1.5 h。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖膠在電壓5 V·cm-1條件下電泳30 min，終結(jié)果用Goodview 染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 引物序列

1.2.3 CAPS標(biāo)記的獲得及抗病基因檢測(cè) 利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)3份抗病純合材料CK1、CK2、CK3及3份感病純合材料CK4、CK5、CK6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用Rsa I酶切，獲得與抗病基因緊密連鎖的CAPS標(biāo)記；利用該標(biāo)記分別對(duì)F1、自交系進(jìn)行抗病基因的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 與Ty-1基因緊密連鎖的CAPS標(biāo)記片段的獲得

6份材料的PCR擴(kuò)增圖譜如圖1，酶切圖譜如圖2。

如圖1顯示，利用特異引物對(duì)6份抗病、感病材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)論抗病材料還是感病材料均擴(kuò)增出400 bp左右的片斷，經(jīng)RsaⅠ酶切后（圖2），3份感病材料產(chǎn)生350 bp和50 bp左右的片段（但較小的50 bp的特異片段難以觀察到，可能是目標(biāo)條帶產(chǎn)物相對(duì)較少，經(jīng)酶切后小片段濃度較低所致）。3份抗病材料不能被 RsaⅠ酶切，仍呈現(xiàn)原來(lái)的 400 bp左右的片段。400 bp和350 bp兩個(gè)片段能將抗病材料和感病材料加以區(qū)分，是與抗病基因連鎖的標(biāo)記。

圖1 6份材料的PCR擴(kuò)增圖譜

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RsaⅠ酶切圖譜

2.2 利用 CAPS標(biāo)記對(duì) 8份抗病番茄 F1進(jìn)行抗病基因檢測(cè)

8份抗病材料的酶切圖譜如圖3。

如圖3所示，8份抗病材料中，迪維斯、TY1415、TY31753份材料酶切后產(chǎn)生400、350 bp和50 bp左右的片段，說(shuō)明這3份材料為含有抗病基因 Ty-1的雜交種；其他材料經(jīng)酶切后只產(chǎn)生350 bp和50 bp左右的片段，和感病對(duì)照的擴(kuò)增片段相同，說(shuō)明這些材料不含抗病基因Ty-1。由于這些材料在田間均表現(xiàn)為抗病，說(shuō)明這些材料可能含有除Ty-1以外的其他抗病基因。

圖3 8份抗病番茄F1的RsaⅠ酶切圖譜

2.3 利用CAPS標(biāo)記對(duì)25份未知抗病性的番茄F1進(jìn)行抗病基因檢測(cè)

25份材料酶切圖譜如圖4。

如圖4所示，25份材料中有17份材料表現(xiàn)為雜合抗病型，酶切后產(chǎn)生400、350 bp和50 bp左右的片段，應(yīng)是含有抗病基因Ty-1的抗病品種；8份材料表現(xiàn)為純合感病基因型，酶切后產(chǎn)生350 bp和50 bp左右的片段，說(shuō)明不含抗病基因Ty-1。

2.4 利用CAPS標(biāo)記對(duì)24份番茄自交系進(jìn)行抗病基因檢測(cè)

24份材料酶切圖譜如圖5所示：24份材料均存在RsaⅠ酶切位點(diǎn)且酶切后均產(chǎn)生350 bp和50 bp左右的片段，與感病對(duì)照的擴(kuò)增片段相同，說(shuō)明這些自交系均不含抗病基因Ty-1。

圖4 25份番茄F1的RsaⅠ酶切圖譜

圖5 24份番茄自交系的RsaⅠ酶切圖譜

3 討論

CAPS標(biāo)記作為一種特異PCR標(biāo)記，不僅比RFLP、AFLP等標(biāo)記快速、簡(jiǎn)便，并且不用使用放射性同位素，減少了對(duì)人體的傷害，而且比RAPD、ISSR等PCR標(biāo)記更穩(wěn)定，特異性更強(qiáng)（于力 等，2008）。隨著分子技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助育種已極大地加快了育種的速度。

本試驗(yàn)找到了一個(gè)有效可用的 CAPS標(biāo)記，為番茄黃化曲葉病毒病分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)，但該標(biāo)記與抗病基因連鎖距離的遠(yuǎn)近，尚需田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。利用獲得的標(biāo)記共對(duì)33份番茄F1進(jìn)行抗病基因的檢測(cè)，有20份材料含有抗病基因Ty-1，13份材料不含Ty-1基因，含有 Ty-1基因的抗病品種多來(lái)自國(guó)外，說(shuō)明國(guó)外抗病材料比較豐富。對(duì) 24份國(guó)內(nèi)骨干育種材料進(jìn)行檢測(cè)，均不含抗病基因Ty-1，說(shuō)明國(guó)內(nèi)進(jìn)行番茄抗TYLCVD育種不能直接利用以往的骨干自交系，需要進(jìn)行材料創(chuàng)新。

不同地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒的變異較大，導(dǎo)致同一個(gè)抗性材料在不同地區(qū)有不同抗性表現(xiàn)，甚至在同一地區(qū)不同年份間抗性表現(xiàn)不同。實(shí)踐表明，選育抗病品種是防治TYLCV最為經(jīng)濟(jì)環(huán)保有效的方法。經(jīng)過(guò)育種家多年的努力，國(guó)外在抗番茄黃化曲葉病毒病育種方面取得了顯著成就。但是目前，抗TYLCVD的商業(yè)雜交種中導(dǎo)入單個(gè)抗性基因的居多，當(dāng)病害大規(guī)模發(fā)生時(shí)，它們的抵抗能力依然下降。提高抗性水平的策略之一就是將多個(gè)抗性基因聚合到一個(gè)品種中，而有關(guān)專(zhuān)家已經(jīng)證明了通過(guò)聚合不同抗源的基因可以提高番茄對(duì)TYLCV的抗性（Vdavski et al.，2008）。付蓉蓉等（2011）的研究已表明，同時(shí)含有純合Ty-1和Ty-3抗性基因的番茄材料有更高更穩(wěn)定的抗性。分子標(biāo)記輔助選擇的最大優(yōu)越性表現(xiàn)在抗性基因累加系的構(gòu)建中，將抗性基因累加到栽培品種是育種上培育持久抗性品種的有效手段之一（余文貴 等，2009）。并且隨著番茄黃化曲葉病毒病的抗性基因 Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4及 Ty-5的定位及分子標(biāo)記工作的進(jìn)行（Zamir et al.，1994；Hanson et al.，2006；Ji et al.，2007，2009；Anbinder et al.，2009），育種學(xué)家可以利用相關(guān)的分子標(biāo)記更加準(zhǔn)確快速地篩選抗源材料，并結(jié)合傳統(tǒng)育種將這些抗性基因聚合到一個(gè)品種中，從而培育出具有更高、更廣、更持久抗性的番茄新品種（付蓉蓉 等，2011）。

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