鄒 敏 唐佳佳 宋洪元

（南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

Napin蛋白是蕓薹屬植物中廣泛存在的一類由多基因編碼的種子貯藏蛋白，為種子發(fā)芽和幼苗生長提供氮源，在ABA的影響下，以組織特異性的方式表達(dá)形成（熊興華 等，2003）。利用油菜種子特異啟動子 Napin將目的基因集中在種子中表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的定時(shí)、定點(diǎn)調(diào)控，減少在其他組織中表達(dá)造成的能量浪費(fèi)，并可避免在植株整體表達(dá)時(shí)可能帶來的生理代謝活動紊亂。目前，已從多個(gè)油菜品種中克隆了Napin啟動子（李麗 等，2001；劉建民 等，2008），并將其用于油料種子中脂肪酸的改良。Tan等（2011）利用Napin A啟動子介導(dǎo)BnLEC1和BnL1L基因在油菜籽中特異表達(dá)，使種子含油量從2%提升到20%。也有報(bào)道稱，由Napin啟動子驅(qū)動抗毒素基因在油菜籽中表達(dá)可以提高植株自身抵御病蟲害的能力（Husken et al.，2005）。除十字花科外，Napin啟動子控制外源基因的表達(dá)在煙草中也表現(xiàn)出了種子特異性（肖娜 等，2008；Swarnalatha et al.，2010）。

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.〕為蕓薹屬一年生或兩年生草本植物，是我國著名的特產(chǎn)蔬菜，通過種子繁殖。因此，獲得高質(zhì)量的種子對芥菜種子發(fā)芽、幼苗生長及增強(qiáng)植株抗病抗逆性等均有重要意義。本試驗(yàn)對油菜種子特異啟動子 Napin控制外源基因在芥菜中的表達(dá)特性進(jìn)行研究，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為報(bào)告基因，將其置于來自油菜的Napin啟動子的調(diào)控之下，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入芥菜，分析其在轉(zhuǎn)基因植株種子及 T1代幼苗中的表達(dá)情況，以期為今后芥菜種子質(zhì)量的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為渝豐榨菜種子，購于重慶市三千種業(yè)有限公司。含有植物表達(dá)載體pCANapEGFP質(zhì)粒（圖1）的根癌農(nóng)桿菌EHA105由南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存；Taq DNA聚合酶、DNA marker等購自北京全式金生物工程有限公司；抗生素卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）、羧芐青霉素（Carb）等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；除草劑 Basta（有效成分為PPT，草丁膦）購于日本化學(xué)工業(yè)株式會社；NAA、6-BA、乙醇、0.1%升汞等為國產(chǎn)試劑。

圖1 pCANapEGFP表達(dá)載體示意圖

1.2 方法

1.2.1 芥菜轉(zhuǎn)化 PPT篩選濃度確定 芥菜無菌苗的獲得參照曹必好等（2003）的方法進(jìn)行，切取苗齡7 d的渝豐榨菜子葉和下胚軸，分別在MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂的分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)（子葉預(yù)培養(yǎng)2 d，下胚軸預(yù)培養(yǎng)14 d至始分化），然后轉(zhuǎn)至分別添加0、2、4、6、8 mg·L-1PPT的分化培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，每次重復(fù)15個(gè)子葉或下胚軸，14 d后統(tǒng)計(jì)各濃度PPT下芥菜子葉及下胚軸的成活率，確定PPT篩選的最佳濃度。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的芥菜轉(zhuǎn)化 參照曹必好等（2003）的方法進(jìn)行并作了適當(dāng)修改：以苗齡7 d的渝豐榨菜下胚軸作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體，以MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂為分化培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)各2 d，農(nóng)桿菌濃度OD600為0.5～0.6，浸菌10 min。篩選培養(yǎng)基為MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂；生根培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+ 0.6%瓊脂。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株總 DNA的提取及 PCR鑒定 轉(zhuǎn)基因芥菜葉片總DNA的提取參照王關(guān)林和方宏筠（2002）的 CTAB法。PCR擴(kuò)增用Napin啟動子的上游引物和EGFP報(bào)告基因的下游引物，Nap-F：5＇-CAAGCTTCTCTCATC CCCTTTTAAACCAAC-3＇；pGFP-2：5＇-TTAC TTGTACAGCTCG TCCATGCCG-3＇。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min 40 s，循環(huán) 30 次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因芥菜中EGFP的表達(dá)檢測 分別取轉(zhuǎn)基因植株開花后15、25、35 d和完熟的種子（圖2）做徒手切片，在熒光顯微鏡（LEICA CTR5000）下分別觀察種皮、子葉和胚根3個(gè)部位，進(jìn)行EGFP的表達(dá)檢測；轉(zhuǎn)基因T1代種子萌芽過程中，分別取根、下胚軸和子葉進(jìn)行熒光表達(dá)檢測。

圖2 不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因芥菜種莢

2 結(jié)果與分析

2.1 PPT濃度對芥菜離體子葉及下胚軸生長的影響

除草劑Basta對植株再生有很強(qiáng)的抑制作用，在基因轉(zhuǎn)化過程中獲得抗性芽的關(guān)鍵是使用合適的篩選壓：除草劑濃度過高，對轉(zhuǎn)化細(xì)胞造成強(qiáng)烈的毒害作用，致使大量外植體在篩選培養(yǎng)基上很快死亡；濃度太低，對抗性芽不能進(jìn)行嚴(yán)格篩選，會產(chǎn)生假抗性芽和大量嵌合體（楊廣東 等，2002；李鵬 等，2008）。從表1可以看出，PPT對芥菜離體子葉及下胚軸的分化均有抑制作用，PPT濃度為2 mg·L-1的分化培養(yǎng)基中子葉的成活率僅64.4%，下胚軸的成活率為37.8%；隨著PPT濃度的升高，子葉和下胚軸的成活率均急劇下降，在PPT濃度為8 mg·L-1時(shí)子葉和下胚軸全部死亡。因此，在篩選培養(yǎng)基中添加濃度為8 mg·L-1的PPT可對轉(zhuǎn)基因芽體進(jìn)行有效篩選。

表1 PPT濃度對芥菜離體子葉和下胚軸生長的影響

2.2 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得及PCR檢測

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化芥菜下胚軸，經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，篩選出抗性芽（圖 3-a），將其切下置于生根培養(yǎng)基上生根（圖 3-b），以獲得抗性植株。對所獲得的4株抗性植株幼葉提取總基因組 DNA，并用 Nap-F和 pGFP-2引物擴(kuò)增Napin啟動子和EGFP報(bào)告基因區(qū)域，結(jié)果均擴(kuò)增出預(yù)期 1.1 kb大小的片段（圖 4），證明所得抗性植株均為轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化芥菜下胚軸的植株再生過程

2.3 Napin-EGFP融合基因在轉(zhuǎn)基因芥菜中的表達(dá)特性

2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株種子的熒光檢測 在開花后15 d的芥菜種子種皮中不能檢測到綠色熒光（圖 5-a），而胚根和子葉中已能檢測到綠色熒光（圖 5-e、i），且以胚根根尖的綠色熒光最強(qiáng)（圖 5-e）。隨著種子發(fā)育，在開花后25 d的種子種皮中能檢測出明顯的綠色熒光（圖5-b），隨著種子繼續(xù)發(fā)育，種皮、胚根和子葉中的綠色熒光均逐漸增強(qiáng)（圖 5-c、d、f、g、h、j、k、l），至種子完熟時(shí)，各部位綠色熒光最強(qiáng)（圖 5-d、h、l）。由此可見，Napin控制外源 EGFP基因在種皮、子葉、胚根中均有表達(dá)，且從種子發(fā)育的某個(gè)時(shí)期開始直到種子完熟，但在種皮中的表達(dá)滯后于在子葉和胚根中的表達(dá)。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因 T1代種子萌發(fā)過程中各部位的熒光檢測 種子萌動時(shí)，芥菜胚根和子葉均能檢測到強(qiáng)的綠色熒光（圖6-a、b）；約1 d后，子葉展開，在幼苗下胚軸和根中仍能檢測到綠色熒光，但下胚軸的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于根中的熒光強(qiáng)度（圖6-c、d）；至幼苗子葉轉(zhuǎn)綠（約2 d），已檢測不出下胚軸中的綠色熒光（圖6-e）；隨著幼苗生長至1片真葉期（約14 d），根中的綠色熒光也消失（圖6-f）。由此可見，在種子萌發(fā)過程中EGFP基因的表達(dá)量沒有增加，即Napin啟動子在該階段并沒有啟動下游基因的表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)基因芥菜中Napin啟動子的鑒定

圖5 轉(zhuǎn)基因芥菜種子各部位的EGFP表達(dá)情況

圖6 轉(zhuǎn)基因T1代種子萌動至幼苗1片真葉期EGFP表達(dá)情況

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將從油菜中克隆的種子特異啟動子 Napin與報(bào)告基因（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因，EGFP）融合，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入芥菜，經(jīng)PPT篩選抗性植株，經(jīng)鑒定所得抗性植株全為轉(zhuǎn)基因植株。通過對轉(zhuǎn)基因芥菜種子及 T1代幼苗進(jìn)行熒光檢測，表明 Napin啟動子驅(qū)動外源EGFP基因在轉(zhuǎn)基因芥菜種子子葉、胚根、種皮中均有表達(dá)，且隨著種子逐漸成熟，種子各部位綠色熒光逐漸增強(qiáng)；在T1代幼苗中的表達(dá)僅在種子萌發(fā)初期的子葉、下胚軸和胚根中存在，至植株生長至1片真葉期時(shí)，各部位綠色熒光全部消失。

出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是 Napin啟動子驅(qū)動基因的表達(dá)與種子發(fā)育階段具有明顯的關(guān)聯(lián)性。Napin啟動子控制外源基因在芥菜中的表達(dá)從種子發(fā)育的某個(gè)時(shí)期開始，直到種子完熟，因此在T1代幼苗生長初期仍存在大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，隨著植株日漸長大，產(chǎn)物相對濃度降低，直至檢測不到。這與Murphy等（1989）認(rèn)為Napin蛋白在油菜中的積累從種子發(fā)育中期開始直到種子完熟變干的結(jié)論相似。這也表明 Napin啟動子控制外源基因的表達(dá)與該蛋白本身的表達(dá)特性相關(guān)，且在屬內(nèi)差異不大。本試驗(yàn)結(jié)果對 Napin啟動子在植物，尤其是蕓薹屬植物中的應(yīng)用提供依據(jù)，將該啟動子用于調(diào)控脂肪酸改良、抗病蟲等基因，可為優(yōu)良種子的生產(chǎn)提供參考。

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