鄭 瑩，霍穎異

（1.中國(guó)大洋礦產(chǎn)資源研究開(kāi)發(fā)協(xié)會(huì)，北京 100080；2.國(guó)家海洋局 第二海洋研究所，國(guó)家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012）

0 引言

浙江省海域面積26萬(wàn)km2且海島眾多，海岸線全長(zhǎng)6 486km，居全國(guó)首位［1］。浙江省海域?qū)儆趤啛釒А貛夂?，利于海洋生物的繁殖和生長(zhǎng)，是生產(chǎn)力較高的海域，其獨(dú)特的海洋環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的海洋微生物資源。然而目前關(guān)于浙江沿海沉積物微生物多樣性的報(bào)道還較少。2008年，霍穎異 等［2］采用可培養(yǎng)和非培養(yǎng)相結(jié)合的方法調(diào)查了浙江蒼南近海沉積物的細(xì)菌多樣性；其他還有些相關(guān)研究報(bào)道多采用平板計(jì)數(shù)或生理生化鑒定的調(diào)查方法［3－4］，未能真實(shí)反映樣品中微生物的分類(lèi)地位和多樣性。

本研究采用純培養(yǎng)方法和基于16SrRNA基因序列，調(diào)查和分析浙江省鎮(zhèn)海潮間帶沉積物的可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成，不但豐富了近海海洋細(xì)菌種質(zhì)資源，初步探討了海洋細(xì)菌群落在生態(tài)系統(tǒng)中作用，對(duì)近海細(xì)菌資源開(kāi)發(fā)也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2008年6月，對(duì)浙江省鎮(zhèn)海潮間帶沉積物插管取樣，將柱狀沉積物樣品進(jìn)行1cm間隔分層分裝，短期4℃陰暗保存，運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后即開(kāi)展相關(guān)工作。本文采用表層0～1cm層沉積物開(kāi)展研究。

1.2 菌株的分離與保藏

采用2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離并純化海洋細(xì)菌。2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基配方為（L－1）：NaCl 19.45g，MgCl2·6H2O 12.6g，MgSO4·7H2O 6.64g，CaCl21.8g，KCl 0.55g，NaHCO30.16g，KBr 0.08g，SrCl2·6H2O 0.057g，H3BO30.022g，Na2SiO3·9H2O 0.093g，NaF 0.002 4g，NH4NO30.002 4g，Na2HPO40.008g，蛋白胨0.5g，酵母抽提物0.1g；用5mol·L－1NaOH將pH值調(diào)至7.2。固體培養(yǎng)基另加20g／L瓊脂粉。

取沉積物樣品約0.5g，放入3mL培養(yǎng)基鹽溶液中。振蕩15min后，使其自然沉降，取上清液10倍梯度稀釋?zhuān)瑢?02、103和104倍稀釋的溶液涂布于平板。每個(gè)梯度涂布3塊平板，分別置于25℃和37℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出明顯菌落后，挑取單菌落并反復(fù)劃線純化菌株。菌株培養(yǎng)液中加入20%（v／v）的甘油混勻，保藏于－80℃。

1.3 PCR擴(kuò)增16SrRNA基因序列

取1mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，以12 000r／min離心1min獲得菌體，并加入200μL無(wú)菌水懸浮菌體。放置沸水浴30min，破細(xì)胞后，冰浴2min，以12 000r／min離心2min并取上清液為PCR模板。PCR擴(kuò) 增 引 物 為 27F（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）和 1492R （5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’）。50μL反應(yīng)體系為 H2O 41μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP 0.5μL，引 物 27F 1μL，引物1492R1μL，模板DNA（50ng／μL）1μL，Taq酶（TaKaRa）0.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用1%（w／v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物后，送至深圳華大基因研究院測(cè)序。

1.4 16SrRNA基因序列分析

將獲得的16SrRNA基因序列通過(guò)EzTaxone［5］（http：//eztaxon－e.ezbiocloud.net／）在線服務(wù)進(jìn)行比對(duì)，獲取相似度較高的近緣物種菌株信息及序列。采用MEGA 5［6］軟件中Clustal W程序進(jìn)行多序列匹配排列，并基于Neighbor－Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

在25℃和37℃下培養(yǎng)后，細(xì)菌在2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)表現(xiàn)為直徑0.3～0.5mm的圓形或不規(guī)則圓形菌落，表面平整、隆起或呈臍狀突起，顏色呈透明、白色、黃色、紅色和橙色等。根據(jù)菌落形態(tài)特征篩選菌株并分離純化，共獲得39株細(xì)菌。

16SrRNA基因序列分子鑒定結(jié)果（表1）表明，這些菌株分別屬于厚壁菌門(mén)Firmicutes（20株，51.3%）、變形桿菌門(mén)Proteobacteria（12株，30.8%）、擬桿菌門(mén) Bacteroidetes（6株，15.4%）和放線菌門(mén)Actinobacteria（1株，2.6%）4個(gè)類(lèi)群。厚壁菌門(mén)的菌株歸屬于芽孢桿菌屬Bacillus、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬Ornithinibacillus和海洋芽孢桿菌屬Thalassobacillus；變形桿菌門(mén)的菌株歸屬于α－變形桿菌綱Alphaproteobacteria的紅環(huán)菌屬Roseicyclus、紅細(xì)菌屬Rhodobacter、赤桿菌屬Erythrobacter、簡(jiǎn)納西氏菌屬Jannaschia和魯杰氏菌屬Ruegeria以及γ－變形桿菌綱Gammaproteobacteria的不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter和假單胞菌屬Pseudomonas；擬桿菌門(mén)的菌株歸屬于嗜冷菌屬Algoriphagus和黃桿菌科Flavobacteriaceae；而放線菌門(mén)的菌株歸屬于戈登氏菌屬Gordonia。

表1 鎮(zhèn)海潮間帶沉積物分離細(xì)菌16SrRNA基因序列同源性比較結(jié)果Tab.1 Homology comparison of 16SrRNA gene sequences of the bacteria isolated from the tidal flat sediment of Zhenhai

續(xù)表1

分離菌株16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）及同源性比較結(jié)果（表1）表明，菌株與相關(guān)已知物種標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列相似性為93.6%～100.0%，說(shuō)明部分菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的相關(guān)菌株之間存在一定的遺傳差異。研究發(fā)現(xiàn)一些菌株與已報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)菌株間的相似度較低，如菌株ZH09與RobiginitaleabiformataHTCC2501T（93.6%）、ZH15 與RhodobacteraestuariiJA29T（97.1%）、ZH17 與RuegeriapomeroyiDSS－3T（97.2%）、ZH38 與AcinetobacterindicusA648T（96.8%），它們可能代表了一些新的分類(lèi)單元。特別是菌株ZH09與已報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列相似性皆小于94%，可能代表了一個(gè)新屬。目前，針對(duì)這些特色菌株的新種鑒定工作正在進(jìn)行，其中，已經(jīng)以菌株ZH17為標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了Ruegeria屬的一個(gè)新種Ruegeriamarina［7］。

3 討論

本研究針對(duì)采集自浙江鎮(zhèn)海潮間帶的沉積物樣品，采用純培養(yǎng)方法以及基于16SrRNA基因序列的分析，分離并鑒定了39株海洋細(xì)菌。分析結(jié)果表明，芽孢桿菌為鎮(zhèn)海潮間帶沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占菌株總數(shù)的46.2%。芽孢桿菌為異養(yǎng)細(xì)菌，它們的大量出現(xiàn)表明該海域環(huán)境中有機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)較為豐富。而芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)種群地位在其他近岸沉積物研究中亦有報(bào)道，如孫風(fēng)芹 等［8］對(duì)南海南沙海域沉積物中可培養(yǎng)微生物的研究發(fā)現(xiàn)，在22個(gè)研究站點(diǎn)中，10個(gè)站點(diǎn)的分離菌株半數(shù)以上為芽孢桿菌；GONTANG et al［9］對(duì)西太平洋群島沉積物的可培養(yǎng)微生物的研究表明，芽孢桿菌是一類(lèi)可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占分離菌株總數(shù)的34.4%。且本研究中75%（20株中的15株）的芽孢桿菌菌株與陸源細(xì)菌而非海洋來(lái)源細(xì)菌有較近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖1），說(shuō)明這些近海海域的微生物可能來(lái)源于陸地。值得注意的是，菌株ZH04和ZH55與砷耐受菌株BacillusindicusSd／3T［10］的相似性為99.9%；菌株 ZH41和 ZH43與BacillussubterraneusDSM 13966T的相似性為99.7%，該菌株可還原 Fe（III）和 Mn（IV）［11］；菌株ZH56與Bacillusthioparans的相似性最高，該種內(nèi)菌株U3可氧化 Mn（II）并吸附Cd、Zn、Cu和Pb等重金屬［12－13］。發(fā)現(xiàn)這些與重金屬氧化還原和吸附相關(guān)的菌株，從某種程度上反映了近年來(lái)重金屬?gòu)U水大量排放導(dǎo)致的沿海海域重金屬污染，也說(shuō)明了陸地人類(lèi)活動(dòng)對(duì)近海海域生態(tài)環(huán)境的影響。這些菌株可能可以在日后應(yīng)用于重金屬污染的土壤修復(fù)和廢水處理。

圖1 鎮(zhèn)海潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌16SrRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of 16SrRNA gene sequences of strains from the tidal flat sediment of Zhenhai

α－變形桿菌為該樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的第二大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占菌株總數(shù)的25.6%，其中又以Roseobacter類(lèi)群菌株為主，包括 ZH40、ZH15、ZH32、ZH18、ZH36、ZH39、ZH50和ZH17八個(gè)菌株。Roseobacter類(lèi)群細(xì)菌是海洋浮游微生物中含量最為豐富的類(lèi)群之一，有研究顯示，大洋的表層海水中，十分之一的細(xì)菌細(xì)胞屬于Roseobacter類(lèi)群，而在近海海水中，該類(lèi)群的比例達(dá)到五分之一［14－15］。Roseobacter類(lèi)群為變形桿菌門(mén)Proteobacteriaα－變形桿菌綱 Alphaproteobacteria紅桿菌目Rhodobacterales紅桿菌科Rhodobacteraceae中的一些海洋浮游細(xì)菌，包括玫瑰桿菌屬Roseobacter、魯杰氏菌屬Ruegeria、簡(jiǎn)納西氏菌屬Jannaschia、紅環(huán)菌屬Roseicyclus、檸檬胞菌屬Citreicella、暗棕色桿菌屬Phaeobacter、玫瑰變色菌屬Roseovarius和亞硫酸鹽桿菌屬Sulfitobacter等17個(gè)屬的40余個(gè)種。Roseobacter類(lèi)群細(xì)菌因其多樣的生理特征，被稱(chēng)為“生態(tài)泛化者”［16－18］，它們?cè)诤Ｑ笱匕渡鷳B(tài)系統(tǒng)的碳和硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。比如，菌株ZH17與無(wú)機(jī)異養(yǎng)菌RuegeriapomeroyiDSS－3T有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，兩者16SrRNA基因序列相似性為97.2%。菌株DSS－3T可利用一氧化碳和硫化物等無(wú)機(jī)物作為能量來(lái)源，從而減少對(duì)有機(jī)碳的消耗［17］。菌株ZH15、ZH40和以ZH18為代表的4個(gè)菌株（ZH18、ZH36、ZH39和ZH50）與紫色非硫光合細(xì)菌（Purple Non－sulfur Bacteria，PNSB）RhodobacteraestuariiJA29T［19］、RhodobactervinaykumariiJA123T［20］和RoseicyclusmahoneyensisML6T［21］有最近的 系 統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系，16SrRNA 基因序列相似性分別為97.1%、98.3%和98.9%。而PNSB是一類(lèi)好氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria，AAPB），因其代謝類(lèi)型多樣而具有重要的生態(tài)學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。PNSB具有光合、固氮、固碳、硝化、反硝化、產(chǎn)氫、硫化物氧化、降解大分子有機(jī)物等多種生理特征，且其富含蛋白質(zhì)、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此PNSB可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理、能源開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)多聚羥基烷酸（PHA）等方面［22］。

4 小結(jié)

通過(guò)對(duì)鎮(zhèn)海潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的研究表明，浙江近海沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，而且它們?cè)诮５脑氐厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。然而，限于培養(yǎng)條件等因素，本研究獲得的菌株還只是浙江近海微生物資源的很小一部分。未來(lái)可通過(guò)分子生態(tài)分析以及優(yōu)化培養(yǎng)條件的手段，獲得更全面的浙江近海微生物資源和多樣性信息。

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