王秀秀，陳紀(jì)新，黃邦欽

（福建省陸海界面生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361005）

0 引言

隨著藻類全基因組測(cè)序物種的增多，赤潮藻蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展也更加蓬勃［1－2］。蛋白質(zhì)雙向電泳樣品提取方法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，但由于不同藻類細(xì)胞內(nèi)生化組成的差別較大，故已經(jīng)廣泛應(yīng)用的植物蛋白提取方法并不適用于藻類［3－4］，而目前尚沒有一種通用的藻類蛋白提取方法，針對(duì)于每一種藻的蛋白提取方法都需優(yōu)化［5］。蛋白的提取是蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵步驟，但在不同的物種中的蛋白提取最適方法差異很大，如銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa的最適提取條件為Triton X－100提取法［6］，亞歷山大藻Alexandriumsp.的最適提取法為Triton X－100－尿素提取法［7］，無菌塔瑪亞歷山大藻Alexandriumtamarense的最適藻類蛋白提取條件為裂解液法［8］。CHAN et al［9］認(rèn)為，直接 TCA－丙酮沉淀法的效果與Tris緩沖液提取法的效果相當(dāng)，但都比裂解液提取法的效果要好。原雅緯 等［8］則認(rèn)為，裂解液結(jié)合TCA－丙酮沉淀法比直接TCA－丙酮沉淀法提取蛋白得到的雙向電泳圖譜要好。

中肋骨條藻Skeletonemacostatum是一種世界性的在沿海和海洋水域起著重要生態(tài)作用的物種，它能支持較高初級(jí)生產(chǎn)力，是我國(guó)長(zhǎng)江口赤潮高發(fā)區(qū)的常見肇事種［10－12］，但這一物種的雙向電泳樣品制備方法目前尚未見報(bào)道。裂解液法和直接三氯乙酸（TCA）－丙酮沉淀法是廣泛使用的藻細(xì)胞蛋白提取方法，本文比較了這兩種方法提取中肋骨條藻的雙向電泳結(jié)果，并優(yōu)化了這一物種的蛋白制備最適條件，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 藻種的培養(yǎng)及收集

實(shí)驗(yàn)所用的中肋骨條藻S.costatum由廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋微型生物保種中心提供，分離自長(zhǎng)江口赤潮高發(fā)區(qū)，經(jīng)18SrDNA鑒定為中肋骨條藻。培養(yǎng)基為f／2培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)所用的海水為南海海盆區(qū)海水，將鹽度調(diào)整為28后使用。培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強(qiáng)度為5 000lx，光暗周期為14∶10（光∶暗）。當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后，在Beckman高速冷凍離心機(jī)中離心收集，條件為8 000 r／min，4℃，離心時(shí)間為20min。藻細(xì)胞沉淀后用經(jīng)高溫、高壓滅菌的海水洗滌并重懸沉淀，按照相同的細(xì)胞數(shù)分裝在4個(gè)離心管中，再次離心收集（條件同上）。藻細(xì)胞沉淀后立即用于提取蛋白。

2 蛋白的提取方法及雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法

眾多藻類蛋白提取方法中裂解液法和直接三氯乙酸（TCA）－丙酮沉淀法是目前最廣為使用的方法。由于不同藻類最適提取方法的差異性，本文實(shí)驗(yàn)中著重比較了裂解液法和直接TCA－丙酮沉淀法提取中肋骨條藻蛋白的效果。

2.1 裂解液法

裂解液法是雙向電泳蛋白制備中的常用方法，是根據(jù)不同原理去除藻類細(xì)胞內(nèi)干擾物，提取藻類全細(xì)胞蛋白的一種方法，其中主要有裂解液－超濾管法（Lysis buffer ＆ microcon法，LM 法）、裂解液－試劑盒法（Lysis buffer ＆2－D clean－up kit法，L－Kit）和裂解液－TCA－丙酮沉淀法（Lysis buffer ＆ TCA－acetone法，LAC）。裂解液－超濾管法是根據(jù)超濾管基于分子量來截留蛋白質(zhì)的原理，利用離心強(qiáng)行使水和其他小分子的鹽類、核酸、多酚、多糖類物質(zhì)通過半透膜將蛋白質(zhì)截留在半透膜上的方法。裂解液－試劑盒法是使用GE Healthcare公司研發(fā)的雜質(zhì)去除試劑盒（即2－D clean－up kit）去除胞內(nèi)雜質(zhì)的方法，該試劑盒使用去污劑和共沉淀劑酸性沉淀蛋白，對(duì)酸性端蛋白和堿性端蛋白都有較好的富集作用［13－14］。裂解液－TCA－丙酮沉淀法是根據(jù)TCA在酸性條件下與蛋白形成不溶性鹽、并作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，使之聚集沉淀的原理富集蛋白質(zhì)［15］。

按照CHAN et al［9］的超速離心方法操作，超聲波破碎緩沖液為0.5mL裂解液。裂解液配方為：濃度為7mol／L的尿素（Bio－Rad公司生產(chǎn)），濃度為2mol／L的硫脲（Bio－Rad公司生產(chǎn)），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的3－［3－（膽 酰 胺 丙 基 ）二 甲 氨 基 ］丙 磺 酸 內(nèi) 鹽（CHAPS，F(xiàn)luka公司生產(chǎn)），濃度為40mmol／L 的Tris，pH值為8.7。使用超聲細(xì)胞破碎儀（型號(hào)為Branson Sonifier S－450D），冰浴超聲波破碎藻細(xì)胞，直到鏡檢99%的藻細(xì)胞均沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)后停止。在Beckman高速冷凍離心機(jī)中，4℃條件下，12 000r／min離心20min，取上清液。將上清液加入到3KD超濾管（GE Healthcare公司生產(chǎn)）里層套管中，按照超濾管說明書操作制備蛋白樣品，保存在－80℃冰箱中備用。

2.1.2 L－Kit法

緩沖液和超聲波條件與LM法相同，冰浴超聲波破碎藻細(xì)胞后離心取上清液。將上清液按照雙向電泳去除試劑盒（2－D clean－up kit，GE Healthcare公司生產(chǎn)）的說明書操作制備蛋白樣品，沉淀保存在－80℃冰箱中備用。

2.1.3 LAC 法

緩沖液和超聲波條件與LM法相同，冰浴超聲波破碎藻細(xì)胞后離心取上清液。在上清液中加入9倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA－丙酮溶液（含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇，Amresco公司生產(chǎn)），－20℃下靜置過夜后14 000r／min條件下離心20min，倒去上清液，在蛋白沉淀中加入含體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮，再次超聲波破碎1min。超聲結(jié)束后用含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮重復(fù)洗滌5次后直至上清液無色，將沉淀的蛋白質(zhì)樣品冷凍離心干燥成粉末狀，保存在－80℃冰箱中備用。

2.2 直接三氯乙酸（TCA）－丙酮沉淀法

直接TCA－丙酮沉淀法是文獻(xiàn)中經(jīng)常報(bào)道的方法，這種方法在去除色素和富集蛋白的方面很有優(yōu)勢(shì)，特別是丙酮對(duì)色素的溶解能力強(qiáng)，且對(duì)微量蛋白具有富集作用［11］，因此是提取藻類細(xì)胞蛋白的一種重要方法。

2.2.1 TCA 丙酮沉淀法－1（TA－1）

按照原雅緯 等［8］的直接TCA－丙酮沉淀法操作，超聲破碎緩沖液為0.5mL預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA－丙酮溶液，冰浴超聲破碎后直接加入9倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA－丙酮溶液，－20℃下靜置30min之后14 000r／min條件下離心20min，倒去上清液，在沉淀物中加入含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮洗滌5次，直至上清液無色后將沉淀的蛋白質(zhì)樣品冷凍離心干燥成粉末狀，保存在－80℃冰箱中備用。

高校所處外部政治經(jīng)濟(jì)環(huán)境不斷變化，自身在不斷發(fā)展中面臨的風(fēng)險(xiǎn)和問題也在不斷變化。而部分高校內(nèi)控僅僅是流于形式的“一次性建設(shè)“，并沒有根據(jù)高校內(nèi)外部環(huán)境的變化進(jìn)行改進(jìn)和調(diào)整，內(nèi)部控制措施和框架存在滯后性和不適應(yīng)性。同時(shí)，高校內(nèi)控缺乏長(zhǎng)期規(guī)劃性，缺乏相應(yīng)的內(nèi)控固化措施。

2.2.2 TCA－丙酮沉淀法－2（TA－2）

超聲破碎藻細(xì)胞的條件和TA－1相同，參考陳富成 等［16］的方法，將－20℃沉淀時(shí)間延長(zhǎng)到12h之后4℃條件下14 000r／min離心20min，倒去上清液，沉淀結(jié)束后用含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮清洗5次，直至上清液無色后將沉淀冷凍離心干燥成粉末狀，保存在－80℃冰箱備用。

2.2.3 TCA－丙酮沉淀法－3（TA－3）

超聲波破碎的條件和TA－1相同，在－20℃沉淀12h。沉淀結(jié)束后在4℃條件下14 000r／min離心20min，取沉淀。加入0.5mL含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮（預(yù)冷），參考董明國(guó)等［17］的方法，再次超聲洗滌1min，超聲結(jié)束后離心，去上清液，取沉淀用。用含有體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β－巰基乙醇的丙酮洗滌5次，直至上清液無色后將沉淀冷凍離心干燥成粉末狀，保存在－80℃冰箱備用。

2.3 蛋白定量

使用相同體積的雙向電泳水化液重新溶解蛋白后，用碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定。

2.4 雙向電泳

使用pH值范圍為3～10的IPG膠條（GE Healthcare公司生產(chǎn)），蛋白上樣量為100μg；使用pH值范圍為4～7的IPG膠條（GE Healthcare公司生產(chǎn)），蛋白上樣量為120μg。等電聚焦儀型號(hào)為Ettan IPGphor 3（GE Healthcare公司出品），雙向電泳條件按照CHAN et al［9］方法設(shè)置，一向等電聚焦結(jié)束后，每根膠條都需要分別在平衡緩沖液中平衡?；A(chǔ)平衡緩沖液配方為：濃度為50mmol／L的Tris，pH值為8.8，濃度為6mol／L的尿素，體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的十二烷基硫酸鈉（SDS，Bio－Rad公司生產(chǎn)），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的二硫蘇糖醇（DTT，Amresco公司生產(chǎn)）。平衡共分兩步，在平衡液I（含有質(zhì)量濃度為2mg／L DTT的基礎(chǔ)平衡液）中平衡15min后，將膠條轉(zhuǎn)移至平衡緩沖液Ⅱ（含有2.5mg／L碘乙酰胺的平衡液基礎(chǔ)溶液，碘乙酰胺為Fluka公司生產(chǎn)）中再平衡15min。將經(jīng)平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至交聯(lián)度為12.5%的聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）上進(jìn)行第二向垂直電泳，所需的丙烯酰胺－甲叉雙丙烯酰胺溶液及濃度為1.5mol／L的Tris－Hcl溶液（pH值為8.8）、垂直電泳槽、掃描儀均為Bio－Rad公司的產(chǎn)品。第二向電泳跑到底部后停止電泳并染色。

2.5 凝膠染色

采用銀染法進(jìn)行凝膠染色［9］，脫色搖床為北京六一儀器廠的產(chǎn)品。

2.6 圖像分析

采用Umax magicscan軟件掃描凝膠圖像，并用PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析。

3 結(jié)果

3.1 中肋骨條藻蛋白樣品全范圍雙向電泳圖譜

圖1為中肋骨條藻蛋白樣品（pH值為3～10）全范圍雙向電泳圖譜。由圖1可見，中肋骨條藻的蛋白點(diǎn)從大分子量到較小分子量分布有序，但大部分集中在酸性端大約pH值為4～7的范圍內(nèi)，且存在高豐度蛋白，堿性端聚焦的蛋白點(diǎn)比較少，因此之后的蛋白提取方法比較中，皆使用pH 4～7的IPG膠條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 中肋骨條藻蛋白樣品全范圍雙向電泳圖（pH值為3～10）Fig.1 2－DE protein profiles of S.costatum protein samples（pH 3～10）

3.2 裂解液法雙向電泳圖譜比較

圖2為不同原理裂解液法去除胞內(nèi)干擾物質(zhì)所得雙向電泳圖。由圖2可見，LM法的雙向電泳圖譜的背景最干凈，對(duì)高分子量和低分子量的蛋白點(diǎn)分離效果良好，共得到136個(gè)蛋白點(diǎn)，有豎紋且堿性端蛋白缺失嚴(yán)重；用L－Kit法得到的雙向電泳圖譜蛋白數(shù)目明顯增多，蛋白點(diǎn)增加到354個(gè)，較小分子量的蛋白點(diǎn)聚焦良好，高分子量的蛋白偏少；用LAC法雙向電泳圖譜得到462個(gè)蛋白點(diǎn)，酸性蛋白、堿性蛋白、大分子量和小分子量的蛋白點(diǎn)分布均勻，但是大分子量蛋白的橫紋和豎紋比較嚴(yán)重。

3.3 直接TCA－丙酮沉淀法雙向電泳圖譜比較

圖3為3種直接TCA－丙酮沉淀法的雙向電泳圖譜。由圖3可見，3種直接TCA－丙酮沉淀法的提取效果大不相同。經(jīng)過比較后發(fā)現(xiàn)，TA－1方法雙向電泳圖譜中的蛋白點(diǎn)較少，共280個(gè)點(diǎn)，橫紋和豎紋均有；TA－2方法雙向電泳圖譜中的酸性端的蛋白拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，幾乎全部是橫紋，得到148個(gè)蛋白點(diǎn)，但偏堿性端的蛋白點(diǎn)數(shù)量較TA－1方法有所提高；TA－3方法雙向電泳圖譜上基本沒有橫紋，較小分子量的高豐度蛋白有輕微豎向拖尾現(xiàn)象，可得到干凈的背景、清晰的蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)的數(shù)目較多，共得到了601個(gè)蛋白點(diǎn)，且酸性蛋白、堿性蛋白、大分子量和小分子量的蛋白分布均勻，是TCA－丙酮沉淀法中效果最好的一種。

4 討論

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一，樣品制備特別是蛋白提取的質(zhì)量是雙向電泳成功與否的關(guān)鍵。由于藻類細(xì)胞內(nèi)生化組成成分的較大差別，目前并沒有一種通用的藻類蛋白提取方法［5］。本文對(duì)中肋骨條藻的蛋白提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)的研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

比較3種裂解液方法提取中肋骨條藻全蛋白雙向電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），LM法、L－Kit法和LAC法提取得到的藻類蛋白的蛋白分布非常相似。LM法的雙向電泳圖譜中的橫、豎紋較多，雖去除細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)的效果非常顯著，但是蛋白點(diǎn)數(shù)量少，可能是由于去除雜質(zhì)的同時(shí)一些小分子量蛋白也有可能流失。實(shí)驗(yàn)中使用的超濾管的孔徑為3KD，為最小孔徑的商業(yè)化超濾管，可見這種方法還有待改善。L－Kit法（2－D clean－up kit）提取到的蛋白點(diǎn)數(shù)量比較多，但是大分子量的蛋白點(diǎn)聚焦效果不好，可能是由于試劑盒對(duì)大分子量蛋白的提取能力比較差所導(dǎo)致。LAC法對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞內(nèi)干擾物質(zhì)的去除效果最好，圖譜上的蛋白點(diǎn)數(shù)量最多，尤其是堿性端和大分子量蛋白的提取量提高，堿性端的蛋白點(diǎn)也大量增加，但可能是由于裂解液中的促溶成分使得干擾物的溶解性增加，導(dǎo)致存在高分子蛋白點(diǎn)聚焦仍然不完全的問題。

研究表明，在酸性條件下TCA可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去［18］，因此不同藻的直接TCA－丙酮沉淀法最適提取條件各異，這可能是由于實(shí)驗(yàn)材料不同造成的，也有可能是由于不同研究者對(duì)樣品沉淀時(shí)間不同（從30min到過夜不等）造成的［8，13，16］。有學(xué)者研究表明，使用 TCA－丙酮沉淀法時(shí)沉淀24h并且加上超聲波清洗后蛋白雙向電泳的效果較好［17］，因此本文優(yōu)化了TCA－丙酮直接沉淀法的實(shí)驗(yàn)條件，將沉淀時(shí)間從30min延長(zhǎng)到12h。從3種直接TCA－丙酮沉淀法得到的中肋骨條藻蛋白的雙向電泳圖譜中可見（圖3），將沉淀時(shí)間延長(zhǎng)到12h后，中肋骨條藻蛋白圖譜堿性端和小分子量蛋白點(diǎn)大量增加（圖3b），但堿性端和小分子量蛋白點(diǎn)在大量增加的同時(shí)，也會(huì)造成與蛋白結(jié)合的TCA更加難于洗滌［18］，使得酸性端蛋白等電聚焦失敗。為解決上述問題，本文增加了在丙酮洗滌時(shí)的超聲波洗滌過程（圖3c），這一過程極大地解決了蛋白中TCA殘留的問題，不僅得到了干凈的背景、清晰的蛋白點(diǎn)，而且蛋白點(diǎn)的數(shù)目較多，酸性端蛋白、堿性端蛋白以及較大分子量和較小分子量的蛋白提取效果均良好，蛋白點(diǎn)在膠面上分布均勻。

將LAC法和TA－3法得到的雙向電泳圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，TA－3方法提取得到的高分子量蛋白的聚焦更完全，且高分子量蛋白區(qū)域的背景更干凈，橫紋和豎紋基本沒有，且TA－3方法提取得到的蛋白點(diǎn)最多，因此本文認(rèn)為TA－3的方法為中肋骨條藻的最適蛋白提取方法。

5 結(jié)論

比較了裂解液法和直接三氯乙酸（TCA）－丙酮沉淀法中肋骨條藻細(xì)胞蛋白樣品的制備方法，結(jié)果表明：直接TCA－丙酮沉淀法是中肋骨條藻最適的蛋白制備法，若沉淀蛋白時(shí)間為12h，且在丙酮洗滌時(shí)增加超聲波洗滌過程則效果為最好。這一方法可得到干凈的背景、清晰的蛋白點(diǎn)，且蛋白點(diǎn)的數(shù)目較多，酸性端蛋白、堿性端蛋白以及較大分子量和較小分子量的蛋白提取效果良好，蛋白點(diǎn)在膠面上分布均勻。

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