童彩環(huán)，錢云霞，鄭偉賢，韓 柳

（寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

0 引言

果 糖－1，6－二 磷 酸 酶 （fructose－1，6－bisphosphatase，F(xiàn)BP，EC 3.1.3.11）糖異生途徑中的關(guān)鍵酶之一，可催化果糖－1，6－二磷酸（fructose－1，6－bisphosphate）水解成果糖－6－磷酸（fructose－6－phosphate）和無(wú)機(jī)磷酸鹽（inorganic phosphate，Pi）［1］。FBP是一個(gè)同源四聚體，由4個(gè)結(jié)構(gòu)相同的單體組成，其催化作用需鎂、錳、鈷或鋅等2價(jià)陽(yáng)離子參與［2］，所以FBP除底物結(jié)合位點(diǎn)外還有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。FBP以活性形式和非活性形式存在［3］，果糖－2，6－二磷酸（fructose－2，6－bisphosphate）和 腺 嘌 呤 核 糖 核 苷 酸（adenosine monophosphate，AMP）都能抑制FBP的催化活性，其中果糖－2，6－二磷酸是直接與活性位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行抑制，而AMP是通過(guò)變構(gòu)調(diào)節(jié)進(jìn)行抑制，即AMP結(jié)合于變構(gòu)位點(diǎn)，影響FBP與金屬離子的結(jié)合，從而抑制FBP的催化活性。除哺乳動(dòng)物外，F(xiàn)BP廣泛存在于細(xì)菌、鳥類、甲殼動(dòng)物、魚類和兩棲類［4－5］。而在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有2種編碼FBP的基因存在，一種稱肝臟型FBP（FBP1），最早發(fā)現(xiàn)于葡萄糖異生作用的組織中，如肝臟，腎臟和消化道；另一種稱為肌肉型FBP（FBP2），僅在骨骼肌中表達(dá)，主要參與乳酸鹽類物質(zhì)的糖異生作用［6－7］。

由于FBP參與調(diào)控糖異生途徑，抑制FBP的活性可以治療小鼠二型糖尿病，因而FBP對(duì)葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要［8］。在魚類尤其是肉食性魚類中，增強(qiáng)肝臟和消化道中的糖異生作用是食物缺乏時(shí)防止血糖波動(dòng)的有利途徑［9］。FBP作為糖異生作用的三大關(guān)鍵酶之一，其編碼序列已在彩虹胡瓜魚Osmerusmordax、斑馬魚Daniorerio、異育銀鯽Caras－siusgibelio和大西洋鮭Salmosalar等少數(shù)幾種魚類中被分離和鑒定。

鱸魚Lateolabraxjaponicus，也叫海鱸、花鱸、七星鱸，屬于鱸形目，是一種廣鹽性的肉食性魚類，也是我國(guó)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要魚類之一?，F(xiàn)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了鱸魚糖異生途徑中的另外2種關(guān)鍵酶：葡萄糖－6－磷酸酶（glucose－6－phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）基因［10－11］。本實(shí)驗(yàn)分離了鱸魚 FBP基因，對(duì)其cDNA和氨基酸序列進(jìn)行了分析，并對(duì)其組織表達(dá)特性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究鱸魚FBP的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用二齡鱸魚購(gòu)于寧波水產(chǎn)品大世界。

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。MS－222為sigma公司產(chǎn)品；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq酶和pMD－18T載體等均為Takara公司產(chǎn)品（大連）；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司。大腸桿菌EscherichiacoliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成

鱸魚經(jīng)MS－222麻醉后取其肝臟，參照Trizol試劑操作提取總RNA，經(jīng)NanoDrop 1000Spectrophotometer檢測(cè)RNA的濃度和純度，用1.2%（w／v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。取1μg總RNA參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑操作說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成肝臟cDNA第一條鏈。

1.3 FBP全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增

根據(jù)其他動(dòng)物的FBP cDNA序列在保守區(qū)分別設(shè)計(jì)兼并引物FBP－F／R克隆核心片段，引物序列見(jiàn)表1。以上述肝臟cDNA為模板，用FBP－F／R擴(kuò)增FBP核心片段。FBP核心片段的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，3min；94 ℃、30s，58～55 ℃、30s，72℃、1min，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)（前4個(gè)循環(huán)退火溫度每循環(huán)下降1℃）；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割膠回收后與pMD18－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)PCR檢測(cè)后將陽(yáng)性克隆送上海英駿生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

在測(cè)序得到的核心序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)FBP的5’RACE和3’RACE特異性引物，序列見(jiàn)表1。參照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書，取鱸魚肝臟總RNA分別合成5’Ready和3’Ready cDNA，用于5’和3’末端cDNA的克隆。PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序方法同上。最后對(duì)所獲得的序列進(jìn)行拼接，獲得FBP全長(zhǎng)cDNA序列。

1.4 FPB的同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，并將鱸魚FBP與彩虹胡瓜魚、斑馬魚、人Homosapiens和小鼠Musmusculus的肝臟型FBP進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。并對(duì)鱸魚FBP與其它已知?jiǎng)游锏腇BP作同源性分析。使用 MEGA 4.0軟件，通過(guò)鄰接法（Neighbor Joining，NJ）對(duì)鱸魚FBP和GenBank中已收錄的其它物種的FBP氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹聚類分析。

1.5 FBP在組織中的表達(dá)分析

以18S為內(nèi)參基因，檢測(cè)FBP在不同組織中的表達(dá)特點(diǎn)。提取鱸魚肝臟、肌肉、脾臟、心臟、眼、腎臟、腸、脂肪、鰓和大腦等10個(gè)組織的RNA，各取1 μg參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)得到的FBP序列，設(shè)計(jì)組織表達(dá)引物FBP－RT－F／R，序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增用引物列表Tab.1 Primers used in PCR

2 結(jié)果

2.1 FBP cDNA的克隆及序列分析

用兼并引物FBP－F和FBP－R進(jìn)行PCR克隆到鱸魚FBP的核心片段741bp，在此基礎(chǔ)上利用引物FBP－5RACE－1／2和 FBP－3RACE－1／2分別進(jìn)行2輪5’RACE和3’RACE PCR，得到5’末端序列724bp和3’末端序列810bp，與核心序列分別有545bp和350bp的重疊。進(jìn)行拼接后得到鱸魚FBP cDNA的全長(zhǎng)為1 357bp，5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)分別為42bp和301bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 014bp，共編碼337個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量約為36.7kD，理論pI為6.90。

2.2 FBP的同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)鱸魚FBP基因與裸蓋魚Anopiopomafimbria（ACQ58743）、彩虹胡瓜魚、斑馬魚、異育銀鯽和大西洋鮭的同源性分別為94.3%，90.8%，89.3%，88.1%和84.1%，與哺乳動(dòng)物中的人、牛BosTaurus、豬Susscrofa和小鼠的肝臟型FBP同 源 性 分 別 為 78.9%，77.8%，77.8% 和75.4%，與人、牛、豬和小鼠的肌肉型FBP的同源性分別為74.9%，75.5%，68.7%和73.7%。

將鱸魚FBP與人、斑馬魚、小鼠和彩虹胡瓜魚的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，鱸魚FBP也具有AMP結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)等功能位點(diǎn)（圖2）。

圖1 鱸魚FBP cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列（＊為終止子）Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of the Lateolabrax japonicus FBP gene（＊indicates terminator）

圖2 鱸魚、人、斑馬魚、小鼠和彩虹胡瓜魚FBP氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequences of FBP of Lateolabrax japonicus，Homo sapiens，Danio rerio，Mus musculus and Osmerus mordax

用MEGA 4.0軟件的鄰接法對(duì)鱸魚和其它魚類、甲殼類、昆蟲類、鳥類和哺乳動(dòng)物的2種FPB型的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。通過(guò)進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)克隆的鱸魚FBP與其它魚類的肝臟型FBP成簇后再與哺乳動(dòng)物的肝臟型FBP聚成一支，然后才與哺乳動(dòng)物的肌肉型FBP匯成簇（圖3）。

圖3 鱸魚和其他物種FBP的氨基酸序列系統(tǒng)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of FBP amino acid sequences of Lateolabrax japonicus and other species

2.3 FPB的組織表達(dá)分析

用RT－PCR檢測(cè)鱸魚FPB基因的組織表達(dá)特點(diǎn)，所檢測(cè)3尾鱸魚的10個(gè)組織包括肝臟、鰓、心臟、腎臟、大腦、眼、腸、脾臟、肌肉和脂肪等。結(jié)果表明FPB僅在肝臟、腸和腎臟這3個(gè)組織中有明顯表達(dá)（圖4）。

3 討論與結(jié)論

圖4 鱸魚FPB組織表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of Lateolabrax Japonicus RXRα，RXRβand RXRγin various tissues

本實(shí)驗(yàn)從鱸魚肝臟cDNA中分離得到FBP的全長(zhǎng)cDNA序列共1 357bp，該序列包含1個(gè)1 014bp的完整開(kāi)放閱讀框，可編碼337個(gè)氨基酸組成的蛋白。序列分析表明，鱸魚FBP含有AMP結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn)，其中活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)有數(shù)處重疊且較在其他物種間更為保守，但AMP結(jié)合位點(diǎn)略有變化，比如AMP結(jié)合位點(diǎn)的第2個(gè)氨基酸小鼠為Q，而鱸魚的為E且和彩虹胡瓜魚、斑馬魚及人的氨基酸相同。已有研究表明，肌肉型FBP和肝臟型FBP對(duì)鈣離子和AMP二種抑制物的敏感程度不同，但二者的AMP結(jié)合位點(diǎn)和金屬結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸差異并不大［12－13］。

在哺乳動(dòng)物中，糖異生作用主要發(fā)生在肝臟中，消化道和腎臟也參與糖異生過(guò)程，是魚類糖異生過(guò)程發(fā)生的3個(gè)主要組織［14－15］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鱸魚糖異生過(guò)程的關(guān)鍵酶FBP的組織特異性表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，該基因只在肝臟、腎臟和腸這3個(gè)組織中表達(dá)，和糖異生作用發(fā)生的組織特異性基本吻合。我們前期的研究結(jié)果表明，鱸魚的另2種糖異生途徑關(guān)鍵酶PEPCK基因和 G6P也主要在這3個(gè)組織中表達(dá)［10－11］，該結(jié)果也和虹鱒魚Oncorhynchusmykiss3種關(guān)鍵限速酶的組織表達(dá)特點(diǎn)一致［9］，但銀鯽的FBP基因（肝臟型）在肝臟、腦、心臟、脾臟、腎臟、腸、肌肉和卵巢等組織中都有表達(dá)，以肝臟表達(dá)量最高［16］。

FBP是糖異生過(guò)程的關(guān)鍵酶之一，在哺乳動(dòng)物中存在2個(gè)編碼FBP的基因，一個(gè)為肝臟型，主要表達(dá)于肝、腎﹑肺和消化道中；另一個(gè)為肌肉型，僅表達(dá)于骨骼肌中。比較肝臟型和肌肉型FBP的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二者間的突變積累推測(cè)FBP復(fù)制成肝臟型大概發(fā)生在3億年前，且用RT－PCR的方法沒(méi)有檢測(cè)到魚類肌肉中存在肌肉型FBP這一基因，因此有人推測(cè)在魚類中沒(méi)有肌肉型 FBP［4，17］。但是，從 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索發(fā)現(xiàn)大西洋鮭和斑馬魚都存2種FBP序列，從同源性分析和進(jìn)化樹結(jié)果看，這2個(gè)基因分別與哺乳動(dòng)物的肌肉型的FBP和肝臟型的FBP聚合。王銳 等［16］也證實(shí)魚類至少存在肝臟型和肌肉型2種類型的FBP，但至今未見(jiàn)關(guān)于魚類肌肉型FBP的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)克隆所得到的FBP與肝臟型的FBP聚為一支，且表達(dá)的組織也與肝臟型的表達(dá)特點(diǎn)一致，推測(cè)該基因?yàn)轺|魚肝臟型FBP，關(guān)于鱸魚中是否還存在另一種肌肉型FBP還有待研究。

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