李 結(jié)，王培園，張 萍，劉遠佳，郭建超，孟祥龍，李國清

（華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642）

賈第鞭毛蟲（Giardiasp.）簡稱賈第蟲，是一種呈全球性分布的重要人獸共患性寄生原蟲，能廣泛寄生于人、哺乳動物、鳥類、兩棲類及嚙齒類動物的腸道，導致腹瀉和消化不良等癥狀，諸多臨床病例和流行病學資料均已證明賈第蟲病是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的原蟲?。?－3］。賈第蟲病是一種水源性傳播的疾病，常年流行但多見于夏季。飲用水被污染是造成該病流行和暴發(fā)的重要因素。本病已被列為全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一［4］。近年來研究顯示，賈第蟲合并人免疫缺陷病毒（HIV）感染，并在同性戀者中流行的報道不斷增多［5］。

近年來，寵物犬賈第蟲感染也較普遍，且可流行和傳播人獸共患的賈第蟲基因型，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。因此，對賈第蟲進行研究就顯得尤為重要。賈第蟲延長因子（elongation factor 1alpha，EF1α）基因是蛋白質(zhì)合成過程中肽鏈延伸所需的蛋白因子的基因，進化速率相對較慢，因此常被用于賈第蟲的基因型鑒定。本試驗以廣州犬糞便中發(fā)現(xiàn)的賈第蟲為研究對象，針對其EF1α基因設計引物，進行PCR擴增、克隆和測序，通過序列分析比對，對本次分離的犬源賈第蟲進行了分子鑒定，為賈第蟲的分子遺傳學和分子診斷學研究及賈第蟲病的防治研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品 犬糞便樣品采自廣東廣州某寵物醫(yī)院。每個糞樣取10g～15g，加5倍自來水攪勻，60目銅篩過濾，將濾液以2 500r／min離心10min，棄上清，按糞便量的5倍體積加入330g／L硫酸鋅漂浮液，然后用小鐵絲環(huán)蘸取漂浮液表層涂片鏡檢。將形態(tài)學鑒定為陽性的糞便樣品保存至4℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒（Stool DNA Kit）、WizardTM DNA Clean－Up System試劑盒、pGEM －T Easy Vector，均為Promega公司產(chǎn)品；dNTPs（2.5mmol／L）、ExTaqDNA 聚合酶、6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、IPTG和X－gal均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merk公司產(chǎn)品；Biometra PCR儀器為德國Biometra公司產(chǎn)品；Bio－RAD電泳系統(tǒng)為美國Bio－RAD公司產(chǎn)品；凝膠圖像分析系統(tǒng)為英國Uvitec公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物設計 將純化后的包囊用Promega公司的糞便提取試劑盒（Stool DNA Kit）抽提賈第蟲全基因組DNA，并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，上游引物 EF：5′－CTGGTCACCGCGACTTCA－3′，下游 引 物 ER：5′－ACTCCTCGGCCTTCTTCC－3′，預期擴增片段為288bp。

1.2.2 PCR擴增目的片段 PCR擴增體系為25μL：EF／ER引物各0.25μL，10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，MgCl23μL，Ex－Taq酶0.25μL，無菌水15μL，DNA樣品2μL。PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，循環(huán)35次；最后72℃5min。同時設置陰性對照組，只加入與樣品DNA量相同的無菌雙蒸水。PCR產(chǎn)物在以0.5×TBE為電泳液的10g／L瓊脂糖凝膠中電泳，0.5mg／L溴化乙錠（EB）染色，紫外分析儀下觀察，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及篩選 用DNA膠回收試劑盒對擴增片段進行純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM－T Easy載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM 109中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含氨芐青霉素和

圖1 犬源賈第蟲EF1α基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1PCR amplification result of EF1αgene from Giardia lamblia

2.3序列測定及分析

犬源賈第蟲EF1α基因PCR擴增序列長為288bp，其序列核苷酸組成（圖3）。將測序結(jié)果在NCBI中進行Blast比對，然后從GenBank中下載IPTG的LB平板上，過夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，進行菌液PCR鑒定，篩選出陽性克隆。

圖3 犬源賈第蟲EF1α基因的序列Fig.3 Sequence of the dog－derived Giardia EF1αgene

1.2.4 序列測定與分析 挑選樣本中鑒定為陽性的菌液送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序，Blast比對測序結(jié)果，然后從GenBank下載相關(guān)序列用DNA Star軟件進行序列分析與比較，并構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

PCR擴增出的片段為288bp左右，與預期目的片段大小一致（圖1）。

2.2克隆、轉(zhuǎn)化及菌液PCR

用純化回收試劑盒回收樣品的PCR產(chǎn)物并將之克隆到pGEM－T Easy載體中，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM 109，然后進行菌液PCR鑒定，得到的片段為288bp左右，與預期目的條帶大小一致（圖2）。相關(guān)序列，采用DNA Star軟件建立系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果表明本次分離的廣州犬源賈第蟲基因型為D型。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2dentification of recombinant plasmids by PCR

圖4 犬源賈第蟲EF1α基因的系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree on EF1αgene of the dog－derived Giardia

3 討論

藍氏賈第蟲（Giardialamblia）是一種呈世界性分布的人獸共感染的寄生性原蟲。據(jù)WHO估計，賈第蟲全世界人口的感染率約為30%，在我國，各地區(qū)感染率不同，約在1%～20%左右（平均約2.54%）［6］。在美國，每年大約有2.8×106人感染賈第蟲，因此賈第蟲被稱為“頭號腸道寄生蟲”［7］。近年來，寵物犬深受人們喜愛，但寵物犬能感染人獸共患賈第蟲基因型，這可能會通過多種途徑傳染給人，對人類健康構(gòu)成潛在威脅［8］。因此，對寵物犬源賈第蟲進行分子鑒定及準確分型具有重要的公共衛(wèi)生意義。

藍氏賈第蟲是一個復雜的集合體，至少可分為7個有效集聚體或基因型（A～G）。其中只有A和B型是人獸共患的基因型，可感染包括人在內(nèi)的大部分哺乳動物。A型主要有AⅠ和AⅡ，AⅠ為人獸共患型，AⅡ只感染動物；B型是人獸共患型且宿主范圍較廣；C和D型主要感染犬；E型可感染反芻動物；F和G型可分別感染貓和家鼠［9］。分子生物學技術(shù)是對賈第蟲進行分子鑒定及基因型鑒定的重要手段，目前，常用于賈第蟲基因型鑒定的分子標記主要有小亞基核糖體RNA基因（SSU－rRNA）、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因（tpi）、谷氨酸脫氫酶基因（gdh）、β－賈第素基因（bg）和α－延伸因子1基因（ef1－α）等［10］。肖淑敏等［11］針對16SrRNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS－rRNA基因序列設計引物，首次對我國分離的牛源賈第蟲進行了基因型鑒定，結(jié)果為E型。朱海波等［12］用16SrRNA基因和gdh基因作為分子標記，對廣東首株犬源賈第蟲進行了基因型鑒定，16S－rRNA基因的序列分析結(jié)果顯示該犬源賈第蟲的基因型為A型，對gdh基因序列進一步分析顯示該基因型為AⅠ亞型，屬于人獸共患基因型。Minvielle M C等［13］利用tpi基因設計引物，對采自阿根廷的60份兒童糞樣進行基因型鑒定，結(jié)果顯示43份為陽性，其中3份為AⅡ型，40份為B型。Caccio S M等［14］用bg基因鑒定出人源賈第蟲的基因型為AⅠ、AⅡ、BⅠ和BⅡ和BⅢ。Lalle M等［15］針對bg基因設計引物對意大利的含有賈第蟲包囊的37份人糞樣和25份狗糞樣進行巢式PCR擴增，結(jié)果顯示，人糞樣中只檢測到A型和B型。狗糞樣中6份為A型，其余均為C型和D型，

本研究根據(jù)GenBank中登錄的賈第蟲EF1α基因序列設計引物，首次對我國廣州犬糞中分離的賈第蟲EF1α基因進行了擴增、克隆和測序。結(jié)果表明，本次分離的犬源賈第蟲基因型為藍氏賈第蟲D型，且EF1α基因適合做分子標記，可準確地對賈第蟲進行基因分型。同時，本試驗所測得的賈第蟲EF1α序列系國內(nèi)首次報道，為賈第蟲的分子遺傳學及分子流行病學的進一步研究提供了有價值的科學資料。

［1］Xiao L，F(xiàn)ayer R.Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission［J］.Int J Parasitol，2008，38（11）：1239－1255.

［2］Sulaiman I M，F(xiàn)ayer R，Bern C，et a1.Triosephosphate isomerase gene characterization and potential zoonotic transmission ofGiardiaduodenalis［J］.Emerg Infect Dis，2003，9（11）：1444－1452.

［3］CacciòS M，Ryan U.Molecular epidemiology of giardiasis［J］.Mol Biochem Parasitol，2008，160（2）：75－80.

［4］Sandhu H，Mahajan R C，Ganguly N K.Flowcytometric assessment of the effect of drugs on Giardia lamblia trophozoitesinvitro［J］.Mol Cell Biochem，2004，265：151－160.

［5］Elmendorf H G，Dawson S C，McCaffery J M.The cytoskeleton of Giardia lamblia［J］.Int J Parasitol，2003，33（1）：3－28.

［6］盧思奇.國內(nèi)藍氏賈第鞭毛蟲研究［J］.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報，1999，6（4）：193－197.

［7］衛(wèi) 茹，田喜風，閻靜波，等.藍氏賈第鞭毛蟲感染的免疫學診斷方法［J］.世界華人消化雜志，2006，14：3487－3492.

［8］Smith H V，Cacci S M，Cook N，et a1.Cryptosporidium and Giardia as foodborne zoonoses［J］.Vet Parasitol，2007，149（1－2）：29－40.

［9］Scaramozzino P，Cave D D，Berrilli F，et al.A study of the prevalence and genotypes of Giardia duodenalis infecting kennelled dogs［J］.Vet J，2009，182（2）：231－234.

［10］CacciòS M，Thompson R C，Mclauchlin J，et al.Unravelling Cryptosporidium and Giardia epidemiology［J］.Trends Parasitol，2005，21（9）：430－437.

［11］肖淑敏，李國清，王 波，等.我國首株牛源賈第蟲的分子鑒定［J］.中國人獸共患病學報，2006，22（9）：861－863.

［12］朱海波，李國清，張 萍，等.廣東首株犬源賈第蟲的基因型鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學，2011，41（2）：143－147.

［13］Minvielle M C，Molina N B，Polverino D，et al.First genotyping of Giardia lamblia from human and animal feces in Ar－gentina，South America［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2008，103（1）：98－103.

［14］CacciòSM，De Giacomo M，Pozio E.et al.Sequence analysis of beta－giardin gene and development of a polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human faecal samples［J］.Int J Parasitol，2002，32（8）：1023－1030.

［15］Lalle M，Pozio E，Capelli G，et al.Genetic heterogeneity at theβ－giardin locus among human and animal isolates of Giardia duodenalis and identification of potentially zoonotic subgenotypes［J］.Int J Parasitol，2005（2）：35：207－213.