鵝肉蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

李俊江，潘道東,2，郭宇星,*，岳 娜，孫楊贏

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

鵝肉蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

李俊江1，潘道東1,2，郭宇星1,*，岳 娜1，孫楊贏1

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

運(yùn)用響應(yīng)面(RSM)分析對(duì)鵝肉蛋白酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抗氧化活性為主要指標(biāo)，水解度為輔助指標(biāo)，研究酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值、固液比、酶添加量對(duì)鵝肉蛋白水解度和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：鵝肉蛋白最佳酶解條件為酶解溫度53℃、酶解液 pH10.5、固液比1:3(m/V)、酶解時(shí)間7.2h，加酶量1200U/g，在此條件下，酶解液對(duì)Fe3+還原力為0.402，水解度可達(dá)34.74%。

鵝肉蛋白；酶解；水解度；抗氧化能力

鵝肉營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，從生物學(xué)價(jià)值上來(lái)看，鵝肉是全價(jià)蛋白質(zhì)。鵝肉中脂肪含量低，而且品質(zhì)好[1]，蛋白質(zhì)酶解有助于改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，在動(dòng)物蛋白水解方面，孫楊贏[2]、唐道邦[3]、宋茹[4]、丁利君[5]、閻欲曉[6]、孟祥河[7]等分別對(duì)雞肉、魷魚(yú)、鱈魚(yú)、文蛤以及牛肉酶解進(jìn)行了研究；國(guó)外Silva[8]、Shahidi[9]、Lahl[10]等對(duì)動(dòng)物水解蛋白的特性和應(yīng)用進(jìn)行闡述；O,Meara等[11]以米氏方程和蘭格繆耳等溫吸附模型為基礎(chǔ)，研究了熟肉的酶解動(dòng)力學(xué)并對(duì)酶解反應(yīng)進(jìn)行了研究。近年來(lái)，已有許多關(guān)于蛋白質(zhì)水解物抗氧化活性的研究報(bào)道，說(shuō)明蛋白中可能蘊(yùn)含著具有抗氧化活性的肽序列，選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌阁w外酶解蛋白有利于釋放出有活性的肽段，但對(duì)鵝肉酶解產(chǎn)物的研究卻較少。

本實(shí)驗(yàn)利用堿性蛋白酶水解鵝肉蛋白，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并研究酶解產(chǎn)物抗氧化活性，旨在為酶解制備生物活性肽和鵝肉的深加工提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝肉(絞碎、冷藏) 市售。

中性蛋白酶(5×104U/g)、木瓜蛋白酶(80×104U/g)、堿性蛋白酶(20×104U/g) 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠(chǎng)制造；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；PHS-3L型精密pH計(jì) 上海今邁儀器儀表有限公司；LDS5-1離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鵝肉的預(yù)處理

從市場(chǎng)上購(gòu)得鵝肉，清水洗凈后，用小刀精心除去脂肪，將鵝肉用自來(lái)水沖洗，去血1h后，冷凍保藏，一段時(shí)間后取出并切成顆粒狀，然后用組織搗碎機(jī)搗成泥狀，放置冰箱冷凍備用。

1.3.2 鵝肉蛋白酶解工藝流程

鵝肉糜(經(jīng)預(yù)處理)→按比例加水勻漿→調(diào)節(jié)pH值→加酶保溫酶解→100℃滅酶15min→4500r/min離心 15min→上清液過(guò)濾→鵝肉蛋白酶解液

1.3.3 總氮含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法[12]。

1.3.4 水解度的測(cè)定

采用茚三酮比色法[13]。

1.3.5 酶解液對(duì)Fe3+還原力的測(cè)定

Yen等[14]和Siddhuraju等[15]研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在聯(lián)系。抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的強(qiáng)弱。

取0.1mL樣品(酶解液)溶于2.00mL 的去離子水中，振蕩使其充分混勻，加2mL 0.2mol/L 的磷酸緩沖液(pH 6.6)，2mL 1%的鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液，混勻后于50℃水浴保溫30min，再加入2mL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后3000r/min 離心10min，取離心后的上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL 0.1%的 FeCl3溶液，混勻后于50℃水浴保溫10min，于波長(zhǎng)700nm 處測(cè)定其吸光度，樣品吸光度越大，則表示還原力越大，即抗氧化活性越強(qiáng)，以去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。

1.3.6 最佳酶種類(lèi)的選擇

表1 各種酶酶解條件比較Table 1 Optimal hydrolysis conditions of 3 different types of proteases

[2-8]的基礎(chǔ)上，選上述3種酶對(duì)鵝肉蛋白進(jìn)行酶解，分別在其適宜的 pH 值 (7.0、7.0、10.0)及溫度(45、45、45℃) 條件下[16-17]，以 1200U/g 的加酶量，酶解鵝肉蛋白6.5h，用茚三酮比色法測(cè)定酶解液吸光度并計(jì)算出相應(yīng)的水解度，并測(cè)定其還原力，通過(guò)比較確定最適宜的酶。

1.3.7 最佳酶解條件的單因素試驗(yàn)

1.3.7.1 最佳酶解時(shí)間的確定

選取堿性蛋白酶，在鵝肉糜、蒸餾水固液比1:3(m/V)、加酶量1200U/g、溫度45℃、pH10.0的條件下，選取酶解時(shí)間為2、4、6、8h，考察酶解時(shí)間對(duì)鵝肉蛋白水解度和還原能力的影響。

1.3.7.2 最佳固液比的確定

選取堿性蛋白酶，在酶解時(shí)間為6h，加酶量1200U/g，酶解溫度45℃，pH10.0的條件下，選取固液比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，考察固液比對(duì)鵝肉蛋白水解度和還原能力的影響。

1.3.7.3 最適加酶量的確定

選取堿性蛋白酶，在酶解時(shí)間為6h，固液比為1:3(m/V)，酶解溫度45℃，pH10.0的條件下，選取酶的添加量為700、900、1100、1200、1300、1500U/g，考察加酶量對(duì)鵝肉蛋白水解度和還原能力的影響。

1.3.7.4 最適pH值的確定

選取堿性蛋白酶，在酶解時(shí)間為6h，固液比為1:3(m/V)，酶解溫度45℃，加酶量1200U/g的條件下，選 取pH值為7、9、10、11、12，考察pH值對(duì)鵝肉蛋白水解度和還原能力的影響。

1.3.7.5 最適酶解溫度的確定

選取堿性蛋白酶，在酶解時(shí)間為6h，固液比為1:3(m/V)，pH10.0，加酶量1200U/g的條件下，選取溫度為40、45、50、55、60℃，考察酶解溫度對(duì)鵝肉蛋白水解度和還原能力的影響。

1.3.8 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。以酶解溫度(X1)、酶解時(shí)間(X2)、pH值(X3)為變量，展開(kāi)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。采用F檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義。數(shù)據(jù)分析軟件采用Design-Expert 7.1.3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Coded and real values of the variables involved in Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶種類(lèi)的選擇

圖1 不同蛋白酶對(duì)鵝肉蛋白酶解效果的影響Fig.1 Effect of protease type on hydrolysis efficiency of goose meat protein

由圖1可知，不同的蛋白酶，由于其水解蛋白質(zhì)時(shí)，作用的位點(diǎn)不同，抗氧化活性就不同，木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)較廣泛，因而可能把一些具有抗氧化活性的多肽水解成短肽，從而降低抗氧化活性，而中性蛋白酶的作用活性位點(diǎn)主要是Leu-Phe-，因而在水解過(guò)程中水解物暴露的活性位點(diǎn)不夠，抗氧化活性較低，而堿性蛋白酶的活性位點(diǎn)為Ala-Leu-Val-Tyr-Phe-Trp-，因而水解過(guò)程中暴露的活性位點(diǎn)較多，對(duì)酶解鵝肉蛋白抗氧化性活性效果最好，其值為0.427，水解度也最大，達(dá)到33.10%，故選取堿性蛋白為本實(shí)驗(yàn)的最適水解酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 酶解時(shí)間的選擇

圖2 酶解時(shí)間的選擇Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of goose meat protein

酶解時(shí)間會(huì)影響鵝肉蛋白的酶解反應(yīng)，時(shí)間短酶解反應(yīng)不徹底，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又有可能出現(xiàn)過(guò)度水解，從而影響鵝肉蛋白抗氧化肽的抗氧化活性。由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)，水解度和抗氧化性不斷增加，當(dāng)時(shí)間為6h時(shí)，對(duì)Fe3+還原能力為0.401，水解度為27.35%，此后，隨著底物逐漸被轉(zhuǎn)化，水解度增加速度變慢，并有平緩的趨勢(shì)，考慮到時(shí)間太長(zhǎng)不利于工業(yè)應(yīng)用，水解度增加也不顯著，因此，綜合考慮水解效率、能源消耗、生產(chǎn)成本的問(wèn)題，最優(yōu)反應(yīng)酶解時(shí)間選擇6h。

2.2.2 固液比的選擇

固液比的變化會(huì)引起酶反應(yīng)體系中底物濃度和酶濃度的變化，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，酶的作用效率較低，導(dǎo)致水解度較低，而底物濃度較低時(shí)，尚有一部分游離酶未與底物結(jié)合，其催化功能沒(méi)有完全發(fā)揮，故水解不完全，進(jìn)而對(duì)酶解液的抗氧化活性產(chǎn)生影響。

圖3 酶解固液比的選擇Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on hydrolysis efficiency of goose meat protein

由圖3可知，隨著固液比的增大，即隨著底物濃度的降低，抗氧化活性和水解度都增加，當(dāng)固液比大于1:4時(shí)，抗氧化活性開(kāi)始下降，可能由于底物濃度減少，底物更好地與酶接觸，加速了酶解反應(yīng)，同時(shí)酶的用量是以底物計(jì)算的，固液比增加，酶的濃度也有所減少，綜合考慮效率及成本的問(wèn)題，因此固液比1:3為最適。

2.2.3 加酶量的選擇

圖4 加量酶的選擇Fig.4 Effect of enzyme dose on hydrolysis efficiency of goose meat protein

加酶量會(huì)引起酶反應(yīng)體系中酶濃度的變化，進(jìn)而影響鵝肉蛋白的酶解效果，從而影響鵝肉蛋白水解度和抗氧化活性。由圖4可知，隨著加酶量的增加，抗氧化性逐漸增大，當(dāng)加酶量為1200U/g左右時(shí)，酶解液的抗氧化活性和水解度均達(dá)到最大值，分別為0.400和24.58%，此后，隨著加酶量的增加，酶解液的抗氧化活性開(kāi)始減小，因此，加酶量為1200U/g左右較為合適。

2.2.4pH值的選擇

圖5 酶解pH值的選擇Fig.5 Effect of pH on hydrolysis efficiency of goose meat protein

pH值影響酶的穩(wěn)定性，改變 pH值大小，即改變?nèi)芤褐?OHˉ濃度，會(huì)影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而影響酶解反應(yīng)，所以pH值對(duì)酶解反應(yīng)影響很大。由圖5可知，隨著pH值的增加，水解度和酶解液的抗氧化活性開(kāi)始逐漸增大，當(dāng)pH10左右時(shí)，水解度和酶解液的抗氧化活性均達(dá)到最大值，分別為0.424和32.00%，此后，隨著pH值增加，水解度和酶解液的抗氧化活性開(kāi)始迅速減小，因此，反應(yīng)體系pH10左右較為合適。

2.2.5 酶解溫度的選擇

圖6 酶解溫度的選擇Fig.6 Effect of temperature on hydrolysis efficiency of goose meat protein

在一定的溫度范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的升高，抗氧化活性不斷增加但超過(guò)一定溫度后，抗氧化活性會(huì)隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)升高溫度，反應(yīng)速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，但溫度過(guò)高，酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率隨之降低。由圖6可知，隨著溫度的升高，水解度和酶解液的抗氧化活性逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，水解度和酶解液的抗氧化活性均達(dá)到最大值，分別為25.19%和0.433，此后，隨著溫度的繼續(xù)升高，水解度和酶解液的抗氧化活性開(kāi)始下降，因此，反應(yīng)溫度50℃左右較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固液比及加酶量對(duì)水解度和抗氧化活性影響不如其他3個(gè)因素，因此以水解溫度、水解時(shí)間、pH值為變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

堿性蛋白酶水解鵝肉蛋白的工藝條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組試驗(yàn)， 5組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)(表3)。由于抗氧化值與水解度不存在線(xiàn)性關(guān)系[3]，但可能在一定范圍內(nèi)水解度對(duì)抗氧化活性有促進(jìn)作用，為了選取鵝肉蛋白抗氧化活性的最大值，因而本實(shí)驗(yàn)把抗氧化活性作為最近水解條件的第一指標(biāo)，水解度作為輔助指標(biāo)，利用Design-Expert 7.1.3軟件對(duì)抗氧化活性Y1與各水解因素進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)式擬合方程為：Y1=0.43+0.051X1+0.017X2ˉ0.002X3ˉ0.025X1X2ˉ 0.008X1X3ˉ0.014X2X3ˉ0.088X12ˉ0.097X22ˉ0.072X32。

表4 抗氧化活性為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model describing reducing power

由表4可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性(P＜0.0001)。而F值為50.04，其模型不顯著概率小于0.0001，失擬項(xiàng)的F值為3.20，存在14.54%的概率失擬，R2為0.9847，表明該回歸方程回歸效果比較好，R2Adj為0.9650，表明該方程可信度高，失擬項(xiàng)不顯著(P＜0.05)，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度良好。

由表5可知，X1(酶解溫度)、X2(酶解時(shí)間)、X1X2(酶解溫度與時(shí)間)，還有全部二次項(xiàng)對(duì)抗氧化活性的影響都顯著，各個(gè)具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，而是二次拋物線(xiàn)的關(guān)系，說(shuō)明響應(yīng)值的變化較為復(fù)雜。由F值可知，酶解溫度(X1)、酶解時(shí)間(X2)在試驗(yàn)過(guò)程中起主要作用，而pH值(X3)對(duì)水解效果影響較小。由以上分析得出，運(yùn)用Design Expert 7.13得出堿性蛋白酶水解鵝肉的最佳工藝參數(shù)。

表5 抗氧化活性為響應(yīng)值的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significant test of each regression coefficient in the fitted quadratic polynomial model describing reducing power

圖7 各因素交互作用對(duì)抗氧化活性的影響Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of different variables on reducing power

通過(guò)圖7即可對(duì)任何兩因素交互影響抗氧化活性效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并從中確定最佳因素水平范圍。結(jié)果表明，酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用對(duì)抗氧化活性影響顯著，其他各因素的交互作用不是很顯著。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)式回歸方程，利用Design Expert 7.1.3 軟件獲得了各因素的最佳酶解條件組合為：酶解溫度52.96℃、酶解時(shí)間7.21h、pH10.46、固液比1:3、加酶量1200U/g，此時(shí)對(duì)Fe3+還原力為0.395，水解度達(dá)35.27%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，選取酶解時(shí)間7.2h，固液比1:3，加酶量1200U/g，pH10.5，酶解溫度53℃，做3組平行實(shí)驗(yàn)，水解度可達(dá)34.74%， 對(duì)Fe3+還原力為0.402所得結(jié)果與最佳理論條件下所得的結(jié)果誤差均在±1%以?xún)?nèi)，由此可見(jiàn)，以抗氧化活性為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)堿性蛋白酶酶解鵝肉蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是行之有效的。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)確定了酶解鵝肉蛋白的最佳用酶為堿性蛋白酶。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)分析，各酶解因素對(duì)鵝肉蛋白酶解液抗氧化活性的影響順序?yàn)椋好附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞pH值。利用響應(yīng)面法優(yōu)化鵝肉抗氧化肽的最佳工藝條件為：酶解溫度53℃、pH10.5、固液比1:3、酶解時(shí)間7.2h，加酶量1200U/g，在此條件下水解鵝肉蛋白，水解度可達(dá)34.74%，對(duì)Fe3+還原力為0.402。此結(jié)果可為今后鵝肉蛋白抗氧化活性肽的分離純化提供有利基礎(chǔ)。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Goose Meat Protein and Antioxidant Activity of Its Hydrolysate

LI Jun-jiang1，PAN Dao-dong1,2，GUO Yu-xing1,*，YUE Na1，SUN Yang-ying1
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This paper deals with the optimization of process conditions for the enzymatic hydrolysis of goose meat protein using response surface methodology (RSM). The effects of hydrolysis time, temperature, pH, solid-to-liquid ratio and enzyme dose on degree of hydrolysis and antioxidant activity of hydrolysates were investigated based on single factor experiments. The optimal hydrolysis conditions were found to be 53 ℃, pH 10.5, 1:3 solid-to-liquid ratio, time 7.2 h,1200 U/g enzyme dose. The degree of hydrolysis under these conditions and the reducing power of the hydrolysate obtained were 34.74% and 0.402, respectively.

goose protein；enzymatic hydrolysis；hydrolysis degree；antioxidant activity

TS251

A

1002-6630(2012)03-0126-05

2011-06-15

國(guó)家水禽(水禽肉類(lèi)加工)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-43-17)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2009366)；江蘇省教育廳高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10KJB550003)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101314)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2011787)；南京師范大學(xué)特聘教授、高層次人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(184070H2B08)

李俊江(1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：jeron1988@163.com

*通信作者：郭宇星(1981—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn