珠母貝糖胺聚糖PG-II誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞凋亡的研究

吳紅棉，金曉石，范秀萍，胡雪瓊，鐘 敏，雷曉凌

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

珠母貝糖胺聚糖PG-II誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞凋亡的研究

吳紅棉，金曉石，范秀萍，胡雪瓊，鐘 敏，雷曉凌

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

目的：探討珠母貝糖胺聚糖PG-II誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞凋亡，從而抑制其增殖。方法：MTT法檢測珠母貝糖胺聚糖PG-II對人宮頸癌HeLa細胞生長的抑制作用。倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察HeLa細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA斷裂片段，流式細胞儀定量檢測細胞凋亡的百分率及對其細胞周期的影響。結(jié)果：MTT法顯示PG-II可抑制人宮頸癌 HeLa細胞的增殖。倒置顯微鏡和熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察可見HeLa細胞凋亡的形態(tài)明顯變化。瓊脂糖凝膠電泳顯示PG-II作用HeLa細胞24h，出現(xiàn)分子質(zhì)量為200bp到2000bp不等的細胞凋亡的特征性DNA梯狀條帶。流式細胞術(shù)測試表明：PG-II可使HeLa細胞阻滯于G1期，劑量為100mg/L作用24h阻滯作用最明顯，凋亡指數(shù)為 42.6%。結(jié)論：珠母貝糖胺聚糖PG-II可能通過誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞凋亡而抑制其增殖。

珠母貝糖胺聚糖；人宮頸癌HeLa細胞；細胞凋亡

馬氏珠母貝(Pinctada martensii(Dunder)) 是我國南海珠母貝的主要貝種，在廣東、廣西部分地區(qū)養(yǎng)殖量極大。珠母貝全臟器俗稱珍珠貝肉，價格低廉，除部分食用外，大部分作為飼餌料，造成該資源的很大浪費，極待開發(fā)利用。本課題組長期從事馬氏珠母貝全臟器活性成分的研究，前期的工作已從馬氏珠母貝全臟器中分離純化得珠母貝糖胺聚糖PG-II，分析測得其總氨基己糖含量分別為59.2%，硫酸基含量為2.9%[1-2]；抗腫瘤實驗表明其對HL-60細胞都有殺傷作用，與臨床抗癌藥(5-氟尿嘧啶)合用有增強抗癌藥抑瘤率的作用[3-4]。本實驗研究珠母貝糖胺聚糖PG-II對人宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響，探討其抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝(Pinctada martensii (Dunder))，購自雷州市流沙鎮(zhèn)珍珠養(yǎng)殖場；珠母貝糖胺聚糖PG-II由本實驗室提純。

人宮頸癌 HeLa細胞 廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所；5-氟尿嘧啶(5-Fu) 市售針劑；瓊脂糖凝膠 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；DNA Ladder分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NAPCO5420-1 CO2培養(yǎng)箱 美國Precision Scientific 公司；EPPENDORF 5417R 型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DG5031酶聯(lián)免疫檢測儀 華東電子管廠；CH30RF 200倒置顯微鏡 日本Olympus 公司；EPICS XL 流式細胞儀 美國Coulter 公司；YLN-200DB凝膠影像分析系統(tǒng) 北京亞力恩機電技術(shù)中心；TE300熒光倒置顯微鏡日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 珠母貝糖胺聚糖的分離純化方法

馬氏珠母貝全臟器經(jīng)雙酶水解、醇沉得到珠母貝糖胺聚糖粗品(CPG)，經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析得PG-II。工藝流程：馬氏珠母貝全臟器→勻漿→蛋白酶雙酶水解→醇沉→洗滌→真空干燥→糖胺聚糖粗品(CPG)→DEAE-52纖維素柱層析→PG-II。

1.3.2MTT法

取細胞濃度為104個/mL對數(shù)生長期的HeLa細胞，體積180μL，加入不同質(zhì)量濃度的藥液20μL(加藥終質(zhì)量濃度為10、 25、50、100mg/L，陽性對照組加入臨床藥物5-Fu(120mg/L)，對照組加入同體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行孔，充分混勻后于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，繼續(xù)培養(yǎng)12、24h(終止培養(yǎng)前6h，每孔加5g/L MTT 20μL)。吸棄上清夜100μL后，每孔加DMSO100μL，振蕩5min，波長570nm處測定吸光度，并計算抑制率和增敏效果[5]。

式中：EA+B為合并用藥的抑制率；EA和EB分別為A藥和B藥單獨用藥的抑制率。

1.3.3 倒置顯微鏡觀察法

將含有細胞的24孔培養(yǎng)板直接置于倒置顯微鏡下觀察。比較經(jīng)過誘導(dǎo)和未經(jīng)過誘導(dǎo)的細胞形態(tài)、大小和有無凋亡小體的出現(xiàn)，記錄結(jié)果。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察法

Hoechst33342標(biāo)記法[5-6]。將預(yù)處理的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)過夜。加入PG-II (終質(zhì)量濃度為100mg/L)、PG-II+5-Fu(終質(zhì)量濃度：PG-II 100mg/L、5-Fu 120mg/L)，刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，用PBS搖床洗滌兩遍，每次3min，吸盡液體。加入0.5mL Hoechst 33342染色液，染色15min。用PBS洗兩遍，每次3min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡檢測，激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右。

1.3.5DNA片斷化電泳

培養(yǎng)細胞用PBS清洗、離心，加入細胞裂解液裂解，高速離心，上清液用酚/氯仿/醇抽提3次，RNA酶消化，然后加到含溴化乙錠1%的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進行電泳，在紫外線燈下觀察和攝影。

1.3.6 流式細胞儀分析[7]

取對數(shù)生長期HeLa細胞，加100mg/L 樣品，另設(shè)空白對照組，于5% CO2孵箱中培養(yǎng)12、24h后加入質(zhì)量分數(shù)0.25%的胰蛋白酶細胞消化，1500r/min離心10min后棄上清，用PBS和體積分數(shù)70%乙醇于ˉ20℃過夜固定，隔天用PBS漂洗后，用20mg/L碘化丙啶(PI)(含RNA酶)避光染色30min，流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率。數(shù)據(jù)用Multicycle分析軟件處理。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以χˉ±s 表示，應(yīng)用SPSS13.0 軟件進行方差分析，P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 珠母貝糖胺聚糖對HeLa細胞增殖的抑制作用

如表1所示，PG-II體外對HeLa細胞有顯著抑制作用，其效果與時間和劑量相關(guān)，100mg/LPG-II作用HeLa細胞12、24h對細胞生長的抑制率分別為27.8% (P＜0.05)和40.0%(P＜0.01)。如表2所示，PG-II與5-Fu聯(lián)合作用抑制率得到極顯著提高(P＜0.001)。說明PG-Ⅱ可抑制HeLa細胞增殖，并可增敏抗腫瘤藥物5-Fu的作用。

2.2 珠母貝糖胺聚糖誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

用倒置顯微鏡觀察PG-II作用下HeLa細胞的形態(tài)學(xué)變化，如圖1所示，對照組細胞形態(tài)呈長梭狀，細胞均勻透亮，貼壁，呈扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細胞緊密相連。加樣品組24h作用后，細胞體積變小，出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落現(xiàn)象，細胞間接觸開始消失，細胞不透亮，輪廓模糊。

表1 PG-II對HeLa細胞的抑制作用(±s, n=3)Table 1 Inhibition effect of PG-II on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

表1 PG-II對HeLa細胞的抑制作用(±s, n=3)Table 1 Inhibition effect of PG-II on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

注：*.與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與對照組相比，有極顯著差異(P＜0.01)。下同。

24h A570nm抑制率/%IC50/(mg/L)A570nm抑制率/%IC50/ (mg/L)對照組0.144±0.0080.140±0.008 5-Fu組1200.097±0.002**32.61840.089±0.004*36.3165 100.124±0.01113.90.127±0.004*9.3 PG-II組250.111±0.005*22.90.107±0.001*23.641.2 500.107±0.012**25.763.80.092±0.002**34.3 1000.104±0.003*27.80.084±0.013**40.0樣品劑量/( mg/L)12h

表2 PG-II與5-Fu合用對HeLa細胞的抑制作用±s, n=3)Table 2 Inhibition effect of PG-II combined with 5-Fu on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

表2 PG-II與5-Fu合用對HeLa細胞的抑制作用±s, n=3)Table 2 Inhibition effect of PG-II combined with 5-Fu on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

注：*** .與對照組相比，有極顯著差異(P＜0.001)；+. 0.85≤q≤1.15，增敏作用為單純相加；+ +. 1.15≤q≤20為增強作用；+ + +. q＞20為顯著增強作用；ˉ. 0.55≤q≤0.85為拮抗作用；ˉˉ.q＜0.55為明顯拮抗作用。

24h A570nm抑制率/%q增敏效果A570nm抑制率/%q增敏效果對照組0.144±0.0080.140±0.008 5-Fu組1200.097±0.002**32.60.089±0.004*36.3 10+1200.090±0.010*37.50.89+0.107±0.007***23.60.56ˉ PG-II+5-Fu組25+1200.079±0.009*45.10.93+0.086±0.006***38.60.75ˉ 50+1200.073±0.004**49.30.99+0.061±0.009***56.40.97+ 100+1200.059±0.022**59.01.15++0.034±0.004***75.71.23++樣品劑量/ (mg/L)12h

圖1 倒置顯微鏡觀察HeLa細胞形態(tài)學(xué)變化(×400)Fig.1 Morphological changes of apoptotic HeLa cells under inverted microscope(×400)

圖2 熒光倒置顯微鏡觀察PG-II誘導(dǎo)HeLa細胞12h后的形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.2 Morphological changes of HeLa cells after 12 h of PG-II induction under inverted fluorescence microscope(×200)

圖3 熒光倒置顯微鏡觀察PG-II誘導(dǎo)HeLa細胞24h后的形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.3 Morphological changes of HeLa cells after 24 h of PG-II induction under inverted fluorescence microscope(×200)

用熒光顯微鏡觀察PG-Ⅱ作用HeLa細胞的形態(tài)學(xué)變化，如圖2、3所示，對照組細胞均質(zhì)透亮，貼壁，呈長梭狀，細胞緊密相連。加樣品組作用12h后，細胞體積縮小，出現(xiàn)皺縮、變圓，細胞膜附近熒光強度增大；作用24h后，細胞體積明顯變小，出現(xiàn)黃綠色熒光邊聚，細胞質(zhì)和細胞核熒光漸弱，直至消失。

2.3 珠母貝糖胺聚糖誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的DNA片段變化

PG-II作用HeLa細胞后的DNA片斷化分析結(jié)果如圖4所示，6h時顯示加樣孔附近出現(xiàn)一段大分子質(zhì)量的條帶，相對分子質(zhì)量為幾萬到幾十萬；12h可見典型的DNA梯狀帶；24h后DNA電泳呈涂片狀，分子質(zhì)量低于200bp的短片段大量出現(xiàn)。說明PG-II作用出現(xiàn)了細胞凋亡的特征性的梯形帶，所產(chǎn)生的DNA梯形帶隨時間延長，條帶越來越亮，顯示出凋亡程度越來越大。

圖4 珠母貝糖胺聚糖誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的DNA片段化分析Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA fragments from HeLa cells after different periods of PG-II induction

2.4 珠母貝糖胺聚糖誘導(dǎo)HeLa細胞阻滯細胞周期的作用

表3 100mg/L PG-Ⅱ作用HeLa細胞后的細胞周期分布±s, n=3)Table 3 Cell cycle distribution of HeLa cells after induction with 100 mg/L PG-Ⅱ (±s, n=3)

表3 100mg/L PG-Ⅱ作用HeLa細胞后的細胞周期分布±s, n=3)Table 3 Cell cycle distribution of HeLa cells after induction with 100 mg/L PG-Ⅱ (±s, n=3)

組別 細胞周期分布/% Sub-G1G0/G1SG2/M對照組(12h)2.13±0.1359.4±0.730.5±0.310.0±0.9實驗組(12h)31.4±2.3**43.2±2.3**46.4±0.7*10.4±1.2對照組(24h)5.44±0.1867.9±1.121.3±2.310.8±0.3實驗組(24h)42.6±2.7**33.0±0.1**58.1±3.6*8.9±0.4

如表3所示，劑量為100mg/L的PG-Ⅱ作用HeLa細胞12h后出現(xiàn)凋亡峰，凋亡指數(shù)為31.4%，G0/G1期細胞百分比減少，S期細胞百分比增加，G2/M期細胞無大的變化；作用24h后出現(xiàn)凋亡峰，凋亡指數(shù)增加為42.6%，G0/G1期細胞百分比顯著減少，S期細胞百分比增加，G2/M期細胞百分比有一定減少。結(jié)果表明：PG-Ⅱ可使HeLa細胞阻滯于G1期。

3 討 論

大量文獻表明，多糖類化合物可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的增殖[6,8-9]。本研究應(yīng)用MTT法檢測到珠母貝糖胺聚糖PG-II可以劑量和時間依賴關(guān)系抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖。

細胞凋亡是由內(nèi)在的有規(guī)律的機制引起的，其特征是細胞首先變圓，隨機與鄰周細胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，核染色體密度增高呈半月形，并凝集在核膜周邊，核仁裂解，進而細胞內(nèi)陷，并芽突形成凋亡小體。用熒光探針染凋亡細胞DNA，即可在熒光顯微鏡下直接觀察核形態(tài)變化[7，10]。本實驗通過倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察，從形態(tài)學(xué)上證實珠母貝糖胺聚糖PG-II能夠誘發(fā)HeLa細胞凋亡，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征。

細胞凋亡時，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180～200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”。本研究中通過瓊脂糖凝膠電泳顯示不同時間段DNA梯帶，發(fā)現(xiàn)PG-II作用HeLa細胞12～24h時，出現(xiàn)分子質(zhì)量為200bp到2000bp不等的細胞凋亡的特征性DNA梯形帶，所產(chǎn)生的DNA梯形帶隨時間延長，條帶越來越亮，顯示出凋亡程度越來越大。此發(fā)現(xiàn)進一步證明了珠母貝糖胺聚糖PG-II能夠誘發(fā)HeLa細胞凋亡。

通過流式細胞儀可分析細胞凋亡時DNA減少的細胞[11]。將DNA減少的細胞繪制在DNA含量直方圖上，在正常G0/G1細胞群前會出現(xiàn)一DNA低染細胞群，稱“亞G1細胞群，Sub-G1”，即凋亡細胞群，該峰的大小代表凋亡細胞的多少。本研究通過流式細胞儀分析表明：劑量為100μg/mL的PG-II作用HeLa細胞出現(xiàn)了凋亡峰，使HeLa細胞阻滯于G1期，且隨作用時間的延長，細胞凋亡比例逐漸增加，作用24h阻滯作用最明顯，凋亡指數(shù)可達42.6%。由此可知，珠母貝糖胺聚糖PG-II對人宮頸癌 Hela細胞增殖有抑制作用，其作用機理可能通過誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞凋亡而抑制其增殖的。

目前認為細胞凋亡的觸發(fā)是一個有多種基因參與的級聯(lián)式表達的結(jié)果，藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡受一個或多個基因的調(diào)控。在細胞凋亡的調(diào)控因素中，Bcl-2家族基因備受矚目，Bcl-2與Baχ基因均屬于Bcl-2家族。Bcl-2是抑制細胞凋亡的主要基因，它不僅能抑制腫瘤細胞凋亡，延長細胞存活；而且能拮抗其他抑癌基因所介導(dǎo)的細胞凋亡。Baχ是與Bcl-2作用相反的基因，它的過表達可以拮抗Bcl-2的促進細胞增殖及抑制凋亡的作用[12]；一方面能和Bcl-2形成異源二聚體抑制凋亡，另一方面其自身還能形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡[13]。對多糖抗腫瘤作用機制的研究也表明，Bcl-2/Bax 兩蛋白之間的比例是細胞凋亡發(fā)生與否的關(guān)鍵因素[14-15]。本研究對其凋亡的分子機制還末做相關(guān)研究，需進一步探討。

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HeLa Cells Apoptosis Induced by Glycosaminoglycan Extracted from Pinctada martensi Dunker

WU Hong-mian，JIN Xiao-shi，F(xiàn)AN Xiu-ping，HU Xue-qiong，ZHONG Min，LEI Xiao-ling (College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Objective: To investigate the apoptosis-inducing and proliferation-inhibitory effect glycosaminoglycan PG-II extracted from Pinctada martensi Dunker on HeLa cells. Methods: The growth-inhibitory effect was tested by MTT assay. Morphological observations on HeLa cells apoptosis were carried out under inverted microscope and inverted fluorescence microscope. The biochemical changes of HeLa cell DNA during apoptosis were observed by agarose gel electrophoresis. The percentage of apoptotic cells and cell cycle blockage were detected by flow cytometry. Results: PG-Ⅱ could inhibit the proliferation of HeLa cells as determined by MTT assay. Morphological changes in apoptotic HeLa cells were observed under inverted microscope and inverted fluorescence microscope. The agarose gel electropherogram of HeLa cells treated with PG-II for 24 h displayed characteristic DNA ladders from apoptotic HeLa cells with molecular mass between 200 bp and 2000 bp. The results of flow cytometry indicated that PG-Ⅱ could block the HeLa cell cycle at the G1 phase and that the largest blocking effect was achieved after treatment for 24 h at the dose of 100 mg/L with an apoptosis index of 42.6%. Conclusion: PG-Ⅱ can induce apoptosis in HeLa cells and consequently inhibit their proliferation.

glycosaminoglycan from Pinctada martensi Dunker；HeLa cell；apoptosis

R151.1

A

1002-6630(2012)03-0238-05

2011-03-21

廣東省教育廳自然科學(xué)研究項目( 04J006)

吳紅棉(1953—)，男，教授，碩士，研究方向為海洋生物活性物質(zhì)。E-mail：hxwz247@163.com