羥基脲抑制鹽酸胍對于酵母朊病毒［PSI＋］的治愈＊

王莉潔，沈曼莉，李 輝，宋有濤，

2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽 110036

酵母朊病毒［PSI＋］，是由酵母細(xì)胞的翻譯終止因子Sup35p（eRF3）在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生淀粉樣聚集引起的［1］。研究表明，酵母朊病毒［PSI＋］在細(xì)胞內(nèi)的聚集、繁殖和遺傳受到分子伴侶Hsp104，Hsp70家族及其輔助因子的調(diào)控［2］，其中分子伴侶 Hsp104的活性對酵母朊病毒［PSI＋］的維持起著重要的作用，當(dāng)其過表達(dá)或活性受到抑制時可以導(dǎo)致［PSI＋］的丟失［3］。早期的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽酸胍（3～5 mmol/L GuHCl）能夠通過競爭性抑制 Hsp104的活性，在細(xì)胞持續(xù)分裂的情況下治愈［PSI＋］為［psi－

］。后來的研究表明，鹽酸胍治愈［PSI＋］的機制可能與鹽酸胍在細(xì)胞分裂時逐步降低［PSI＋］遺傳繁殖過程中的“種子”數(shù)目有關(guān)，而與鹽酸胍在細(xì)胞外促進(jìn)蛋白變性的功能無關(guān)［4－5］。那么細(xì)胞分裂在被抑制的情況下，鹽酸胍能否治愈酵母朊病毒［PSI＋］，這個問題引起了研究者的廣泛關(guān)注。2005年Wu等通過利用熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)（FRAP）監(jiān)測［PSI＋］酵母活細(xì)胞中Sup35p－GFP聚集體變化情況時發(fā)現(xiàn)，α因子和法尼醇（抑制DNA連接酶和組蛋白轉(zhuǎn)移酶活性）雖然抑制了酵母細(xì)胞分裂，但是不影響鹽酸胍對［PSI＋］的治愈［6］。2007年 Tuite等通過遺傳表型實驗發(fā)現(xiàn)，α因子和法尼醇（或兩性霉素B）在抑制細(xì)胞分裂的同時也抑制了鹽酸胍對酵母朊病毒［PSI＋］的治愈［7］。受到實驗手段的局限，迄今細(xì)胞分裂受抑制與鹽酸胍治愈［PSI＋］的關(guān)系仍未十分明確。

本研究采用羥基脲（阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸，選擇性地阻礙DNA合成，對RNA及蛋白質(zhì)合成并無阻斷作用）作為細(xì)胞分裂的抑制劑，利用半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDD－AGE）結(jié)合蛋白質(zhì)印跡（Western blot）技術(shù)［8］，比較羥基脲和鹽酸胍共同作用下［PSI＋］細(xì)胞裂解液中Sup35p的聚集體存在形式，從蛋白水平分析了羥基脲抑制細(xì)胞分裂情況下的鹽酸胍對酵母細(xì)胞內(nèi)朊病毒［PSI＋］聚集體大小的影響及兩者相關(guān)性。結(jié)果表明，當(dāng)羥基脲抑制酵母細(xì)胞分裂時鹽酸胍不能將［PSI＋］細(xì)胞治愈為［psi－］，其原因可能與羥基脲使得鹽酸胍解聚酵母朊病毒聚集體的能力明顯下降有關(guān)。這些數(shù)據(jù)在一定程度上支持了Tuite等提出的鹽酸胍治愈需要細(xì)胞分裂的假說。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉均購自上海奧博星生物科技有限公司；尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腺嘌呤購自美國Solarbio公司；鹽酸胍（GuHCl）、羥基脲（Hydroxyurea）購自Sigma－Aldrich公司，ECL試劑購自碧云天生物有限公司，兔抗－GFP抗體及兔抗綿羊IgG二抗均購自金斯特生物科技有限公司。

1.1.2 菌株 野生型酵母（NMC）MATαkar1SUQ5ade2－1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3－52sup35：：KanMX/pJ501，［PSI＋］，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）Masison D.C.博士惠贈。重組型酵母（NGMC）：MATαkar1SUQ5ade2－1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3－52sup35：：KanMX/pJ510，［GPSI＋］，本實驗室構(gòu)建。將［PSI＋］或［GPSI＋］細(xì)胞劃線于含有5mmol/L鹽酸胍的1/2YPD固體平板上培養(yǎng)7d后，分離紅色單菌落得到［psi－］或［Gpsi－

］細(xì)胞。

1.1.3 培養(yǎng)基1/2YPD培養(yǎng)基 酵母浸粉0.5%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；SD－Ade培養(yǎng)基：酵母氮源0.7%，葡萄糖2%，尿嘧啶20mg/L，色氨酸20mg/L，亮氨酸60mg/L；1/2YPD＋5mmol/L GuHCl培養(yǎng)基：同1/2YPD，滅菌后加入0.5%的1mol/L GuHCl儲液；1/2YPD＋ Hydro 培 養(yǎng) 基：同 1/2YPD，滅菌后加入固體羥基脲1.521g/50mL，使得終濃度為0.4mol/L。固體平板加入2%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 羥基脲對于酵母朊病毒［PSI＋］的致死率和生長曲線分析 從新鮮YPD平板挑取的酵母［PSI＋］菌落經(jīng)12h活化培養(yǎng)至OD600＝1.0左右，接種到含有不同藥物的培養(yǎng)基中（菌液終濃度為OD600＝0.02），30℃，170r/min培養(yǎng)，每隔2h取藥物作用后的菌懸液，采用光電比濁法測定其OD值，繪制生長曲線；同時，將菌懸液稀釋涂板，30℃，培養(yǎng)3d，待菌落長出后分別統(tǒng)計不同培養(yǎng)時間下羥基脲作用的酵母［PSI＋］細(xì)胞致死率（致死率%＝100%－存活菌落數(shù)目×稀釋倍數(shù)/活菌總數(shù)）。

1.2.2 羥基脲和鹽酸胍共同作用下酵母朊病毒［PSI＋］表型及治愈率統(tǒng)計 將不同培養(yǎng)時間下羥基脲和鹽酸胍共同作用與單獨鹽酸胍作用下的［PSI＋］菌落分別進(jìn)行稀釋涂布于1/2YPD，30℃培養(yǎng)5d～7d。待菌落顏色不再變化時，統(tǒng)計總菌落數(shù)以及顏色變紅的菌落數(shù)，計算兩種情況下酵母朊病毒［PSI＋］菌落治愈率（治愈率＝紅色菌落總數(shù)/總菌落數(shù)×100%）。

1.2.3 羥基脲和鹽酸胍共同作用下的酵母朊病毒［PSI＋］表型分析 挑取不同時期鹽酸胍單獨作用、鹽酸胍和羥基脲共同作用后的固體培養(yǎng)基上生長的紅色和白色菌落，分別劃線于1/2YPD固體平板上，30℃培養(yǎng)1d，隨后分別影印到SD－Ade和含有5 mmol/L鹽酸胍的1/2YPD培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d～5d，觀察顏色變化及菌落生長狀態(tài)。

1.2.4 SDD－AGE/Western blot檢測 將羥基脲和鹽酸胍作用后的酵母朊病毒［PSI＋］菌懸液，離心后收集菌體；采用無菌蒸餾水清洗去除殘余藥物后懸浮菌液，離心后棄上清；隨后加1ml裂解液將菌體懸浮，采用珠磨破碎儀振蕩破碎細(xì)胞，30s4次，隨后，離心收集上清蛋白樣品。取新鮮蛋白樣品加入0.1%SDS，42℃溫浴10min，采用1.5%瓊脂糖（0.1%SDS）進(jìn)行半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDDAGE），恒壓100V，1h；隨后轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1h，以兔抗－GFP抗體（1∶1 000）孵育4℃過夜，隨后加入到HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000）孵育1h，采用ECL發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行放射自顯影檢測［9］。

2 結(jié) 果

2.1 羥基脲對于酵母朊病毒［PSI＋］活細(xì)胞的毒性分析 由于羥基脲對于酵母細(xì)胞生長存在著較高的毒性，本研究分別對單獨鹽酸胍、單獨羥基脲、羥基脲和鹽酸胍共同作用3種條件下的酵母［PSI＋］細(xì)胞生長情況進(jìn)行了研究。從圖1的生長曲線可以看出，單獨鹽酸胍作用的酵母［PSI＋］細(xì)胞能夠正常生長，前6h處于延滯期，在6h～24h處于對數(shù)期，24h后處于穩(wěn)定期。而單獨羥基脲、羥基脲和鹽酸胍共同作用的酵母［PSI＋］細(xì)胞生長受到抑制，延滯期后細(xì)胞分裂停止。根據(jù)稀釋后涂板的菌落生長數(shù)目，單獨羥基脲、羥基脲和鹽酸胍共同作用6h以內(nèi)的酵母［PSI＋］細(xì)胞致死率為50%左右，與對照和單獨鹽酸胍作用的區(qū)別不大；6h后，對照和單獨鹽酸胍作用的酵母［PSI＋］細(xì)胞致死率逐漸下降到20%左右，而羥基脲和鹽酸胍共同作用的細(xì)胞致死率＞70%，24h后＞90%。

圖1 羥基脲對于酵母朊病毒［PSI＋］細(xì)胞致死率和生長曲線影響Fig.1 Effects of hydroxyurea on the cell mortality（left）and growth（right）of［PSI＋］cells

2.2 羥基脲對鹽酸胍治愈［PSI＋］表型的影響 在［PSI＋］細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集體形式存在，導(dǎo)致無義突變抑制ade2－1突變株產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，使［PSI＋］細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的培養(yǎng)基上生長為白色菌落；在 ［psi－］細(xì)胞中，Sup35p主要以可溶形式存在，非無義抑制的ade2－1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長，細(xì)胞由于累積腺嘌呤合成途徑中的紅色中間產(chǎn)物而形成紅色菌落，這個顏色指示系統(tǒng)可用來初步分析酵母朊病毒的存在狀態(tài)［10］。

圖2 羥基脲抑制細(xì)胞分裂下的鹽酸胍治愈酵母朊病毒［PSI＋］的情況Fig.2 Effects of hydroxyurea on guanidine hydrochloride curing yeast［PSI＋］prion

圖3（A）羥基脲和鹽酸胍共同作用出現(xiàn)的白色菌落表型分析；（B）、（C）單獨鹽酸胍治愈下出現(xiàn)的紅色和白色菌落表型分析Fig.3（A）：Phenotype analysis of the white colonies from combined action of hydroxyurea and guanidine hydrochloride；（B）and（C）：Phenotype analysis of the white and red colonies from guanidine hydrochloride treatment，respectively

如圖2所示，細(xì)胞正常分裂狀態(tài)下［PSI＋］細(xì)胞在1/2YPD液體培養(yǎng)48h之后涂板始終保持白色菌落形態(tài)，菌落數(shù)目呈現(xiàn)增加趨勢；而加入鹽酸胍的［PSI＋］細(xì)胞，在培養(yǎng)24h之后逐漸出現(xiàn)紅色菌落，且紅色菌落比率隨著培養(yǎng)時間的增加而上升。只加入羥基脲的［PSI＋］細(xì)胞，在48h稀釋后單菌落經(jīng)過平板培養(yǎng)觀察僅呈現(xiàn)白色菌落形態(tài)，菌落數(shù)目隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸減少，說明細(xì)胞分裂受到了抑制。值得注意的是，羥基脲和鹽酸胍共同作用下的［PSI＋］細(xì)胞雖然菌落數(shù)目隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸減少，但是在48h后幾乎沒有出現(xiàn)紅色菌落。通過紅、白表型顏色進(jìn)行統(tǒng)計的結(jié)果顯示，48h之后［PSI＋］細(xì)胞的自發(fā)回復(fù)突變率為0.3%，鹽酸胍對［PSI＋］細(xì)胞的治愈率為35.8%，而羥基脲和鹽酸胍共同作用的治愈率為0.1%。從表型來看，這暗示著羥基脲的加入使鹽酸胍基本不能將［PSI＋］治愈為［psi－］菌落。

2.3 羥基脲和鹽酸胍共同作用［PSI＋］酵母細(xì)胞的表型分析 正常的［PSI＋］細(xì)胞能夠在SD－Ade培養(yǎng)基上生長（圖3B），同時能夠在含有鹽酸胍的1/2YPD固體培養(yǎng)基上被治愈為紅色［psi－］菌落，且顏色表型能穩(wěn)定遺傳（圖3C）［10］。

為了詳細(xì)研究羥基脲對鹽酸胍作用白色酵母朊病毒［PSI＋］表型的影響，我們將圖2中羥基脲和鹽酸胍同時作用后形成的白色［PSI＋］菌落隨機挑取50個，并采用影印方法觀察其菌落在不同培養(yǎng)基上的生長情況。如圖3A所示，羥基脲和鹽酸胍共同作用后的白色［PSI＋］菌落，雖然在SD－Ade培養(yǎng)基上能夠正常生長，但不能在含有鹽酸胍的1/2YPD固體培養(yǎng)基上被治愈。因此，根據(jù)以上表型分析的結(jié)果，我們初步推測羥基脲和鹽酸胍共同作用后產(chǎn)生的白色［PSI＋］表型，可能是由于羥基脲的遺傳毒性導(dǎo)致了酵母細(xì)胞某些代謝途徑過程中的基因發(fā)生了改變，生成不能被鹽酸胍治愈的［PSI＋］菌落，即生成了不依賴于 Hsp104的［PSI＋］［11］。

2.4 羥基脲和鹽酸胍共同作用［PSI＋］酵母細(xì)胞的蛋白水平分析 在［PSI＋］細(xì)胞中，Sup35p蛋白呈現(xiàn)具有一定SDS抗性的不可溶狀態(tài)，形成分子量較大的聚集體；而在［psi－］細(xì)胞中，Sup35p為可溶性的單體。聚集體的分子量大小是反映酵母朊病毒［PSI＋］聚集程度的重要指標(biāo)，而利用SDD－AGE/Western Blot技術(shù)，可以在蛋白水平檢測細(xì)胞內(nèi)朊病毒聚集體分子量的大?。?2］。

基于圖1的實驗結(jié)果，由于羥基脲對于細(xì)胞正常分裂和生長存在較強的抑制作用，因此我們僅選取羥基脲和鹽酸胍共同作用4h的［PSI＋］菌懸液，用珠磨儀破碎細(xì)胞提取蛋白樣本，進(jìn)行SDD－AGE/Western Blot檢測。如圖4A所示，對照的［PSI＋］細(xì)胞中的Sup35p主要以混合的聚集體的形式存在，其分子量在600kDa以上；而［psi－］細(xì)胞中的Sup35p主要以單體形式存在，由于本蛋白實驗體系使用了帶有GFP標(biāo)簽的Sup35p（NGMC），其單體分子量為100kDa左右，在半變性的瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)拖尾的單帶。單獨加入羥基脲4h后對［PSI＋］細(xì)胞中Sup35p蛋白的聚集形式并沒有明顯的影響。單獨加入鹽酸胍4h后，［PSI＋］細(xì)胞中Sup35p蛋白的聚集體分子量逐漸變大，并伴隨有少量的單體出現(xiàn)，說明鹽酸胍抑制了Hsp104的“切割”作用，同時降低了朊病毒“種子”聚集Sup35p的單體能力，這與此前的研究結(jié)果是一致的［13］。值得注意的是，羥基脲和鹽酸胍同時加入4h后，［PSI＋］細(xì)胞中Sup35p蛋白聚集體的分子量與對照的［PSI＋］細(xì)胞相比略微增大，但遠(yuǎn)小于鹽酸胍單獨作用的［PSI＋］細(xì)胞，并且未出現(xiàn)單體形式的Sup35p蛋白。隨后，我們利用Quantity One軟件對SDD－AGE/Western Blot結(jié)果進(jìn)行了定量分析（圖4B）。以上蛋白水平的結(jié)果暗示著羥基脲能夠抑制鹽酸胍對酵母朊病毒［PSI＋］的治愈，這與表型分析的結(jié)果是一致的。

圖4 羥基脲和鹽酸胍共同作用下Sup35p蛋白聚集體大小的SDD－AGE/Western Blot分析Fig.4 Size of SDS－resistant Sup35p polymers in hydroxyurea and guanidine hydrochloride－treated cells by SDDAGE/Western blot analysis

3 結(jié) 論

以上研究結(jié)果表明，羥基脲抑制細(xì)胞分裂的情況下，從表型的實驗數(shù)據(jù)來看，鹽酸胍不能治愈酵母朊病毒［PSI＋］。蛋白水平的實驗數(shù)據(jù)證實了這一結(jié)論并發(fā)現(xiàn)，羥基脲的存在使得鹽酸胍解聚酵母朊病毒聚集體的能力明顯下降。這暗示著鹽酸胍治愈朊病毒［PSI＋］是需要細(xì)胞進(jìn)行分裂的，與Tutie等提出的假說相一致。本研究彌補了單純的基于表型研究與細(xì)胞水平分析鹽酸胍治愈酵母朊病毒［PSI＋］的一些不足，為進(jìn)一步研究酵母朊病毒［PSI＋］的聚集、解聚機制及傳代、繁殖機制也提供了一個新的思路。

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