孔令燦

(南京醫(yī)科大學附屬無錫市疾病預防控制中心,江蘇 無錫 214023)

金屬納米簇是一種由幾個到幾百個原子組成的納米材料[1-6]。由于它們的直徑(<2 nm)與電子的費米波長非常類似,因此能顯示出不連續(xù)的電子能級和發(fā)光行為[7-11]。金屬納米簇的合成成本低、毒性小、生物相容性好而且結構確定,這些優(yōu)勢使金屬納米簇成為催化、發(fā)光、生物成像和超分子組裝研究的理想模型,近年來引起了人們的廣泛關注[12-14]。目前,人們提出了各種各樣的合成策略,如化學還原、化學刻蝕和光還原制備小分子、多肽、蛋白質和DNA穩(wěn)定的金屬納米簇[15-18]。然而,這些方法要么需要還原劑(如硼氫化鈉),要么需要加熱,要么納米簇不發(fā)光,給金屬納米簇的廣泛應用帶來了一定的毒性和限制。

利用納米簇和納米簇之間的強相互作用構筑金屬納米簇組裝體是一個很好的解決策略[19-22]。張皓等[19]利用簇間強疏水-疏水相互作用制備了形貌和發(fā)光可調的銅納米簇聚集體。據(jù)此可以預料,簇間的強氫鍵相互作用也能夠制備強發(fā)光的銅納米簇聚集體。然而,氫鍵穩(wěn)定的金屬納米簇聚集體大部分不發(fā)光,主要由于它們的有序性和緊密性不足。因此,如何控制氫鍵的有序性和緊密性,進而制備出具有強發(fā)光的金屬納米簇聚集體,特別是價格便宜的銅納米簇聚集體仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。

本課題組前期利用金納米簇、銀納米簇以及銅納米簇實現(xiàn)了細胞以及細菌內多種重金屬的可視化檢測和細胞成像[23-26],但是對于氫鍵穩(wěn)定的發(fā)光聚集體能否順利跨過細胞膜以及跨過細胞膜后聚集誘導發(fā)光能否保持,進而實現(xiàn)細胞成像以及依賴于溫度的胞內成像尚不清楚。氫鍵穩(wěn)定的聚集體的細胞毒性也不明確,這嚴重影響了銅納米簇聚集體在生物醫(yī)學方面的應用。

基于以上考慮,本研究利用手性D-青霉胺作為穩(wěn)定劑“一步法”合成了具有強發(fā)光的銅納米簇聚集體,并利用紅外光譜、熱重分析、X-射線光電子能譜、X-射線衍射、質譜、掃描電鏡、透射電鏡、發(fā)光光譜和激光共聚焦顯微鏡對其進行了詳細研究。本研究為銅納米簇聚集體的綠色構筑、強發(fā)光的實現(xiàn)以及細胞中的應用提供了一個很好的模型和思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Vario EL cube型元素分析儀(德國Elementar公司);Nicolet Nexus 470型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司);Thermo ESCALAB 250Xi型X-射線光電子能譜儀(美國Thermo Scientific公司);TG/DTA 6300型熱重分析儀(日本TG/DTA 6300公司);X’Pert-Pro MPD型X-射線粉末衍射儀(荷蘭Panalytical公司);6220 LC/MS-TOF型質譜儀(美國Agilent公司);Quanta 400 FEG型掃描電子顯微鏡(美國FEI公司);JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);UV-2550型紫外可見吸收光譜儀(日本島津公司);F-4500型發(fā)光光譜儀(日本Hitachi公司);FLS920型發(fā)光壽命(英國Edinburgh公司);Olympus Fluoview FV1000型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

D-青霉胺(DPA,純度≥98%),五水硫酸銅(CuSO4·5H2O,純度≥98%),均購于阿拉丁生化科技股份有限公司(中國上海)。

1.2 銅納米簇聚集體的合成

將190 mg(1.27 mmol) D-青霉胺溶于200 mL水中,加入CuSO4·5H2O(40 mg,0.16 mmol,5 mL),室溫攪拌40 min。隨后在10000 r/min條件下離心5 min移除溶劑,固體凍干,得到32.6 mg白色固體,產(chǎn)率96%。元素分析,(CuDPA)n,實測值(計算值),%:C 28.63(28.28); H 4.67(4.71); N 6.29(6.60)。

1.3 測試與表征

將銅納米簇聚集體在低溫下凍干,測量紅外光譜、X-射線光電子能譜、熱重以及粉末X-射線衍射;將凍干的銅納米簇聚集體分散在甲醇中測量質譜;將銅納米簇聚集體粉末分散在水中,并滴在硅片和銅網(wǎng)上干燥,然后在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡上測量銅納米簇聚集體的微觀結構;將銅納米簇聚集體粉末分散在水中測量紫外可見吸收光譜、發(fā)光光譜以及發(fā)光壽命。

按照文獻方法測定銅納米簇聚集體的細胞毒性和細胞成像[23]。具體過程如下:將人肝癌HepG2細胞接種在Dulbecco’s修飾的Eagle’s介質中,加入10 μL 10%(體積分數(shù),下同)的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素,然后在96孔板中培養(yǎng)24 h。將不同濃度的銅納米簇聚集體分散在Dulbecco’s磷酸緩沖液中,替換上述細胞培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h。根據(jù)MTT方法測量銅納米簇聚集體的細胞毒性,每個樣品平行測量6次。對于細胞成像實驗,將銅納米簇聚集體溶液(60 μg/mL)和HepG2細胞在激光共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。將細胞培養(yǎng)液傾倒,并加入少量PBS緩沖溶液清洗細胞表面殘留的銅納米簇聚集體3次,利用激光共聚焦顯微鏡進行測量。

2 結果與討論

2.1 銅納米簇聚集體的合成和表征分析

銅納米簇聚集體是D-青霉胺和CuSO4·5H2O在水中通過“一鍋法”合成的。合成方法雖然簡單但產(chǎn)率很高(96%)。根據(jù)反應4RSH+2Cu2+→2RSCu+RS-SR+4H+(RSH為D-青霉胺)可以清晰地看出:合成純度高產(chǎn)率好的銅納米簇聚集體需要投入更多的D-青霉胺,這是由于D-青霉胺既是配體又是還原劑。從節(jié)約成本以及合成高純度的銅納米簇聚集體的角度考慮,選擇了物質的量分數(shù)8倍于CuSO4·5H2O的D-青霉胺作為反應物。紅外光譜中位于2510 cm-1和2608 cm-1處的透射峰消失,表明S—H鍵發(fā)生了斷裂,如圖1(a)所示。X-射線光電子能譜出現(xiàn)了Cu 2p,N 1s,C 1s,S 2p的電子結合峰,表明銅納米簇聚集體已經(jīng)形成,如圖1(b)所示。銅元素和硫元素的物質的量之比為0.96∶1.00,說明銅納米簇聚集體的化學式是(CuSR)n。在圖1(c)和圖2中,銅納米簇聚集體的化學式進一步得到了熱重分析和質譜結果的證實。熱重分析結果顯示,灼燒后的金屬質量是原來聚集體質量的30.6%,與理論結果30.2%一致[26]。質譜數(shù)據(jù)表明,銅納米簇聚集體構筑基元中最大的分子離子峰是Cu6(SR)6。由于缺少單晶結構,銅納米簇聚集體的精確結構目前還不能確定,但它們的化學式可以確定為(CuSR)n。為了更好地認識銅納米簇聚集體的內部結果,本研究測量了它們的X-射線粉末衍射(PXRD),PXRD分析結果表明,銅納米簇聚集體不僅具有很強的衍射峰,而且衍射成比例關系,如D1,D2,D3和d1,d2,d3,說明銅納米簇聚集體不僅結晶性好而且是一種層狀結構,如圖1(d)所示。從化學式(CuSR)n中可以看出,銅納米簇聚集體中的配體間存在很強的羧基-氨基氫鍵,它們可能驅動銅納米簇沿著a,b,c晶軸中的1個或者2個有序排列,另1個晶軸中可能存在多個銅原子形成的銅-銅作用,這種現(xiàn)象在文獻中也有報道[27-29]。通過計算,銅納米簇聚集體中的層間距為1.280 nm(d1)和0.900 nm(D1)。

ν/nm-1

m/z

2.2 銅納米簇聚集體的形貌和光學性質分析

為了更深入地認識銅納米簇聚集體的結構,本研究通過掃描電鏡、透射電鏡以及高分辨透射電鏡對它們的形貌進行了詳細研究。掃描電鏡顯示,銅納米簇聚集體是多層片狀結構,這些片層結構堆積在一起形成了1～2 μm的不規(guī)則聚集體,如圖3(a)所示。這種不規(guī)則的聚集體也可以從透射電鏡中觀察到,如圖3(b)所示。由高分辨透射電子顯微鏡確定了聚集體是納米簇的聚集體,如圖3(c)所示。從圖3(c)中可以看出,多個納米簇堆積在一起且具有很好的晶格條紋,晶格之間的距離約為0.250 nm,這與粉末X-射線衍射是一致的(2θ=35.8°,此衍射峰對應的層間距離是0.251 nm)。

圖3 銅納米簇聚集體:(a)掃描電鏡;(b)透射電鏡和(c)高分辨透射電鏡照片

為了深入認識堆積緊密、排列有序的銅納米簇聚集體,本研究對其進行了光學性質研究。紫外可見吸收光譜表明,銅納米簇聚集體具有顯著的吸收行為,最大吸收峰在308 nm,如圖4(a)所示。通過在360 nm激發(fā),銅納米簇聚集體顯示了很強的聚集誘導發(fā)光,發(fā)光峰位在615 nm,如圖4(b)所示。聚集體粉末的絕對發(fā)光量子產(chǎn)率高達30.4%,這樣高的發(fā)光量子產(chǎn)率說明銅納米簇聚集體的剛性很強,進一步表明青霉胺配體間存在很強的氫鍵相互作用。強的氫鍵作用減小了納米簇聚集體的非輻射躍遷導致發(fā)光增強。銅納米簇聚集體的發(fā)光壽命為25.2 μs。這種微秒級別的發(fā)光壽命以及最大吸收峰和最大發(fā)光峰之間的巨大差值(307 nm)表明銅納米簇聚集體的發(fā)光是磷光。

波長/納米

2.3 銅納米簇聚集體的細胞毒性效應、細胞成像以及依賴于溫度的細胞成像

結構穩(wěn)定、強發(fā)光的銅納米簇聚集體可能在生物方面具有很好的應用前景,比如細胞成像?；诖?本研究分析了銅納米簇聚集體的細胞毒性和細胞成像行為。將人肝癌HepG2細胞與不同濃度的銅納米簇聚集體(0,20,40,60,80,100 μg/mL)一起培養(yǎng)24 h后看到細胞的存活率在93%以上,這一結果說明D-青霉胺穩(wěn)定的銅納米簇聚集體具有很低的細胞毒性以及良好的生物相容性(圖5)。接著以濃度為100 μg/mL的銅納米簇聚集體為例研究銅納米簇聚集體的細胞成像。將銅納米簇聚集體和HepG2細胞一起培養(yǎng)24 h后,可以看到細胞內顯示了很強的發(fā)光,幾乎沒有細胞死亡,說明銅納米簇聚集體具有良好的生物相容性和很小的細胞毒性(圖6)。有趣的是,進入細胞的銅納米簇聚集體顯示了很強的綠色發(fā)光,這與它們胞外的紅色發(fā)光有所不同,說明銅納米簇聚集體進入細胞的過程中可能和細胞中的蛋白、多肽等物質形成了一定的相互作用,影響了銅納米簇聚集體中的銅-銅距離,最終導致發(fā)光顏色變化。

波度/(μg·mL-1)

圖6 人肝癌HepG2細胞的(a)亮場,(b)共聚焦熒光以及(c)亮場和共聚焦熒光復合后的激光共聚焦成像照片

考慮銅納米簇聚集體具有依賴于溫度的發(fā)光行為,即當溫度升高時發(fā)光減弱,這是由于溫度升高增加了銅納米簇聚集體以非輻射躍遷形式釋放能量的機會(圖7)。在細胞成像的基礎上,進一步詳細研究依賴于溫度的熒光成像行為。將銅納米簇聚集體和人肝癌HepG2細胞分別在25 ℃,35 ℃和45 ℃條件下一起培養(yǎng),并測量了細胞成像(圖8～10)。在其它溫度下HepG2細胞也顯示了綠色發(fā)光,進一步說明銅納米簇聚集體和細胞內的蛋白質或者多肽有一定的相互作用,影響了銅納米簇聚集體中的銅-銅距離,最終導致發(fā)光顏色變化。而且,隨著溫度的升高,細胞體內的發(fā)光明顯減弱,說明銅納米簇聚集體在細胞內的結構沒有破壞,可以用來在細胞內探測溫度。

λ/nm

圖8 人肝癌HepG2細胞在25 ℃的(a)亮場,(b)共聚焦熒光以及(c)亮場和共聚焦熒光復合在一起的激光共聚焦成像照片

圖9 人肝癌HepG2細胞在35℃的(a)亮場,(b)共聚焦熒光以及(c)亮場和共聚焦熒光復合在一起的激光共聚焦成像照片

圖10 人肝癌HepG2細胞在45 ℃的(a)亮場,(b)共聚焦熒光以及(c)亮場和共聚焦熒光復合在一起的激光共聚焦成像照片

3 結論

本文以D-青霉胺為配體在室溫下“一步法”

合成了強發(fā)光的銅納米簇聚集體,并通過紅外光譜、熱重分析、X-射線光電子能譜、X-射線衍射、質譜、掃描電鏡、透射電鏡、發(fā)光光譜和激光共聚焦顯微鏡表征手段對其進行了詳細研究。銅納米簇聚集體的絕對發(fā)光量子產(chǎn)率高達30.4%,這在發(fā)光銅納米簇中是非常罕見的。這種強發(fā)光行為是銅納米簇之間強氫鍵作用導致的。此外,這些銅納米簇聚集體顯示了很低的細胞毒性,可以用于細胞成像以及胞內溫度傳感。本研究不僅為銅納米簇聚集體合成、發(fā)光和生物應用提供了一個很好的模型,而且為其它金屬納米簇聚集體的設計和應用提供了重要參考和指導。