姜春曉，王 婷，張彥峰，孫紅文

基因組改組選育抗鎘菌及生物修復(fù)鎘污染土壤

姜春曉1,2，王 婷1，張彥峰1，孫紅文1

(1. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院教育部環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；2. 廣州市環(huán)境保護(hù)工程設(shè)計(jì)院有限公司，廣州 510115)

為了獲得對土壤重金屬污染物具有高效固定能力的微生物，將基因組改組技術(shù)用于構(gòu)造對鎘具有高效耐受性和富集性微生物．以前期獲得的6株抗鎘誘變菌為出發(fā)菌株，經(jīng)3輪基因組改組獲取2株高抗鎘融合菌——F178和F185，對鎘最小受抑制濃度為4.0,mmol/L和4.2,mmol/L，與出發(fā)菌株(0.08～0.25,mmol/L)相比顯著提高．盆栽實(shí)驗(yàn)考察2株菌對(10±0.4),mg/kg鎘污染土壤的修復(fù)效果．同時(shí)添加諾沃肥，F(xiàn)178和F185分別顯著降低蘿卜體內(nèi)的鎘含量至0.3,mg/kg和0.4,mg/kg，而對照組蘿卜體內(nèi)鎘的含量達(dá)2.24,mg/kg；生物量得到顯著提高，是對照的近2倍．添加F178和F185進(jìn)行復(fù)合處理，鎘含量可進(jìn)一步降至0.17,mg/kg，達(dá)到FAO/WHO食品安全質(zhì)量限量標(biāo)準(zhǔn)(0.2,mg/kg)．

重金屬；土壤；原生質(zhì)體融合；生物修復(fù)

菌種選育技術(shù)一直在應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域受到高度重視，其發(fā)展經(jīng)歷了自然選育、誘變育種、代謝控制育種、雜交育種和分子育種等幾個(gè)重要階段[1]．采用傳統(tǒng)的誘變育種，以單一出發(fā)菌株為親本，經(jīng)連續(xù)多代誘變，往往導(dǎo)致后代菌株間遺傳多樣性降低．原生質(zhì)體融合是新興的育種技術(shù)，但是一般要求親代具有遺傳標(biāo)記，這將導(dǎo)致融合菌代“先天不足”．美國加州Maxgen公司Cardayré等提出了基因組改組(genome shuffling）技術(shù)，大大提高了獲得優(yōu)良性狀菌株的幾率．基因組改組技術(shù)已在工業(yè)微生物育種中得到廣泛應(yīng)用[2]，能優(yōu)化大多數(shù)工業(yè)產(chǎn)物的代謝途徑和表型，可直接用于食品工業(yè)[3]、醫(yī)藥衛(wèi)生[4]等眾多生產(chǎn)領(lǐng)域．

微生物固定是土壤中低中度重金屬污染修復(fù)的一個(gè)重要技術(shù)，篩選和培育對重金屬具有高耐受性和富集性的微生物菌株一直是該研究的重點(diǎn)和前沿[5-6]．微生物富集固定重金屬主要由基因決定，如果能將活性基因集中到一株微生物體內(nèi)，可大大提高微生物對重金屬的耐受性(抗性）及富集固定能力．利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建抗重金屬微生物，操作繁瑣，很難成功．而基因組改組技術(shù)，簡單易行，可不必將基因分離出來，實(shí)現(xiàn)多株抗重金屬微生物之間的融合，從而構(gòu)建高效抗重金屬微生物．目前，還沒有關(guān)于利用基因組重組技術(shù)構(gòu)建抗重金屬工程菌的報(bào)道．

筆者以利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)獲得的6株抗鎘誘變菌株為出發(fā)菌，利用基因組改組技術(shù)對6種菌株進(jìn)行融合，以期獲得比出發(fā)菌抗鎘性能更高的融合菌株．經(jīng)過3輪基因組改組技術(shù)，篩選出了2株高效抗鎘融合菌，并利用盆栽實(shí)驗(yàn)考察了2種融合菌對鎘污染土壤的生物強(qiáng)化修復(fù)效果．

1 材料與方法

1.1 材 料

基因組改組用到的6株誘變菌株，由前期實(shí)驗(yàn)通過紫外誘變和亞硝酸鹽化學(xué)誘變，在梯度濃度鎘存在下篩選獲得．其中C14是以熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)的原生質(zhì)體經(jīng)紫外誘變5,min獲得的，C44是C.,tropicalis原生質(zhì)體經(jīng)過亞硝酸誘變10,min獲得的，B42與B41是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分別經(jīng)過紫外誘變1,min和5,min獲得的，B65和B310是B.,subtilis經(jīng)過亞硝酸誘變10,min和20,min獲得的[7]．

采用高滲緩沖液(PBS)作為穩(wěn)定劑，于0.2,mol/L pH 6.0磷酸緩沖液(PB)中加入0.8,mol/L 山梨醇配制而成．

對于酵母菌而言，制備原生質(zhì)體的前預(yù)處理是必不可少的．預(yù)處理液包括：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.2% β-巰基乙醇的PB溶液，0.06,mol/L,EDTA；100,mmol/L TrisHCl，5,mmol/L EDTA，5,mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)．

用2% 蝸牛酶水解細(xì)菌的細(xì)胞壁；用2% 蝸牛酶來水解酵母菌的細(xì)胞壁．酶溶液均是由PBS緩沖液配制，并用0.45,μm膜過濾除菌[1,8]．

40% 的聚乙二醇(PEG4000)由PBS配制．細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨10,g/L，氯化鈉5,g/L，牛肉膏5,g/L，pH7.2；酵母菌培養(yǎng)基為葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基(YEPD)：葡萄糖20,g，蛋白胨20,g，酵母膏10,g，蒸餾水1,000,mL，pH 7.0；營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(NB)：蛋白胨10,g，牛肉膏5,g，NaCl 5,g，葡萄糖5,g，瓊脂20,g，蒸餾水1,000,mL，pH 7.5；融合菌再生營養(yǎng)肉湯瓊脂(RNB)培養(yǎng)基：蛋白胨10,g，牛肉膏5,g，NaCl 5,g，葡萄糖5,g，瓊脂20,g，PBS溶液1,000,mL，pH 7.5[9]．

1.2 B. subtilis誘變菌原生質(zhì)體的制備

將4株B.,subtilis誘變菌分別接種于斜面，37,℃培養(yǎng)24,h，活化2代．轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37,℃振蕩過夜．按1%～2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期中段，3,500,r/min離心10,min，用PBS緩沖液洗滌菌體2次．用新鮮配制的溶菌酶液懸浮，置于37～40,℃條件下緩慢振蕩酶解，每隔15,min取樣鏡檢原生質(zhì)體形成情況，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞都轉(zhuǎn)化成原生質(zhì)體時(shí)(60～90,min)，離心，終止酶解，PBS緩沖液洗滌2次，重新將原生質(zhì)體懸浮于PBS緩沖液中，低溫保存?zhèn)溆肹1,10]．

1.3 C. tropicalis誘變菌原生質(zhì)體的制備

將2株C.,tropicalis誘變菌分別接種于YEPD培養(yǎng)基斜面，28～30,℃培養(yǎng)24,h，活化2代．轉(zhuǎn)接于YEPD液體培養(yǎng)基中(加少量的2-脫氧葡萄糖)，28～30,℃,振蕩過夜．以1%～2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期中段．3,500,r/min下離心10,min，用PB緩沖液洗滌菌體2次．加入β-巰基乙醇-PB溶液，28,℃恒溫10,min，離心，用PB緩沖液洗滌．上述預(yù)處理過程對于酵母菌來說是必不可少的．預(yù)處理后的細(xì)胞沉淀物加入蝸牛酶溶液懸浮，28～30,℃下低速振蕩恒溫水解，每隔15,min取樣鏡檢觀察．當(dāng)大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化成球形的原生質(zhì)體時(shí)(60～90,min)，離心，終止酶解，PBS緩沖液洗滌2次，重新將原生質(zhì)體懸浮于PBS緩沖液中，低溫保存?zhèn)溆肹1,11]．

1.4 基因組改組

將上述方法獲得的6株原生質(zhì)體各取0.5,mL(約1×106,個(gè)/mL)進(jìn)行均勻混合，進(jìn)行第1輪基因組改組．

用PBS緩沖液洗滌1次，3,500,r/min離心10,min棄去上清液，原生質(zhì)體沉淀用少量的PBS緩沖液懸浮，然后加入40%的PEG-PBS溶液，振蕩均勻．30,℃靜止保溫30～60,min，離心，除去PEG，用PBS溶液洗滌2次，原生質(zhì)體沉淀用PBS溶液懸?。m當(dāng)稀釋后，采用雙層平板法涂布于RNB培養(yǎng)基平板上，于28,℃培養(yǎng)，長出菌落后，轉(zhuǎn)接到NB斜面上保存．利用濃度梯度平板和搖瓶發(fā)酵(添加鎘濃度為1,mmol/L的Cd(NO3)2)兩步篩選方法，挑選高抗鎘的融合菌，經(jīng)過遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)鑒定后，將挑選出的菌株在NB斜面上保存，即為第1輪基因組改組獲得的抗鎘融合菌[1]．

制備上面篩選的5株融合菌菌株原生質(zhì)體，將鎘濃度提高為2 mmol/L和 4,mmol/L Cd(NO3)2，其他步驟同上，進(jìn)行第2輪和第3輪基因組重組[1]．

1.5 融合菌對鎘的抗性實(shí)驗(yàn)

將3輪獲得基因組改組融合菌(菌液濃度均為106,個(gè)/mL)分別在含1～5,mmol/L Cd(NO3)2濃度梯度的NB瓊脂平板上劃線培養(yǎng)7,d后，確定鎘對融合菌最小抑制濃度 (minimum inhibition concentration，MIC)．

1.6 盆栽實(shí)驗(yàn)

利用盆栽實(shí)驗(yàn)考察抗鎘菌株對鎘污染土壤的修復(fù)效果．以球形蘿卜為對象(種子購自天津市種子管理站)，實(shí)驗(yàn)土壤采自天津市武清區(qū)，實(shí)驗(yàn)前使用Cd(NO3)2對土壤染毒(10,mg/kg)，混勻后放置2周，測得土壤中鎘的含量為(10±0.4),mg/kg．土壤中添加的諾沃肥來源于天津市開發(fā)區(qū)諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，諾沃肥是生產(chǎn)酶制劑的發(fā)酵殘?jiān)?，?jīng)過添加石灰、高溫滅菌和脫水處理加工制成．采用標(biāo)準(zhǔn)方法測定土壤和諾沃肥的若干理化性質(zhì)．

設(shè)置4個(gè)盆栽處理，分別是對照(S)、僅接種融合菌(SB)、僅添加2%諾沃肥(SN)以及同時(shí)添加諾沃肥并接種微生物的生物強(qiáng)化處理(SNB)．應(yīng)用于盆栽實(shí)驗(yàn)的菌株為來自第3輪基因組改組得到的2株具有穩(wěn)定遺傳性的抗鎘融合菌(F178和F185)，分別單獨(dú)添加F178和F185，并將F178和F185按照體積比1∶1混合添加，接種量為3,mg(菌株干重)/g(土)．上述處理的土壤在室溫下風(fēng)干，混合均勻．然后栽種蘿卜種子，培養(yǎng)60,d，定期補(bǔ)充水分．測定蘿卜地下部鎘含量并稱量蘿卜地下部干重．

1.7 重金屬含量的測定

采用WX-4000型微波消解儀(上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司)對干化土壤和蔬菜樣品進(jìn)行消解．消解完全后，采用WFX-210型石墨爐原子吸收分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)測定Cd含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組改組過程中原生質(zhì)體融合的鏡檢結(jié)果

由鏡檢結(jié)果(見圖1)可以發(fā)現(xiàn)，有大量的原生質(zhì)體之間發(fā)生了融合現(xiàn)象．由此證明，利用本文采用的實(shí)驗(yàn)條件，可以實(shí)現(xiàn)不同原生質(zhì)體的有效融合．

圖1 基因組改組過程中微生物的原生質(zhì)體融合Fig.1 Photograph of protoplast fusion in the process of genome shuffling

圖2 3輪基因組改組獲得的融合菌對鎘的最小耐受濃度Fig.2 Minimum inhibition concentration to cadmium of fused strains after three rounds of genome shuffling

2.2 基因組改組獲得的融合菌對鎘的抗性

圖2為3輪基因組改組篩選到的融合菌對鎘的抗性．第1輪基因組改組獲得5株融合菌，分別是F35～F39，鎘對這5株融合菌的MIC與出發(fā)菌的6株菌(MIC：0.08～0.25,mmol/L)相比，沒有顯著差異(P＞0.05)．第2輪基因組改組共篩選到3株融合菌，分別是F20、F31和F23，鎘對這3株融合菌的MIC與出發(fā)菌株相比，顯著提高，對鎘的抗性濃度范圍為2.2～2.5,mmol/L．第3輪基因組改組獲得2株融合菌F178和 F185，其MIC分別達(dá)到4,mmol/L和4.2,mmol/L，說明第3輪基因組改組能進(jìn)一步提高融合菌對鎘的抗性．將第2輪和第3輪獲得的5株抗鎘融合菌株分別在含鎘2,mmol/L和4,mmol/L的瓊脂平板上劃線(見圖3)，由圖3結(jié)果可知，在2,mmol/L的含鎘平板上，5株菌株生長狀況良好；而在4,mmol/L的含鎘平板上，只有第3輪篩選到的F178和F185菌株可以生長．實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，基因組改組技術(shù)可以進(jìn)一步提高誘變菌株的抗鎘性能．經(jīng)過多代培養(yǎng)，2株融合菌對鎘的抗性穩(wěn)定，均保持在4,mmol/L左右．

圖3 融合菌株在含鎘平板培養(yǎng)基上的生長Fig.3 Growth of fused strains on plates containing cadmium

2.3 融合菌對鎘污染土壤的修復(fù)效果

供試土壤和諾沃肥的主要理化性質(zhì)見表1．

圖4顯示，單獨(dú)接種F178及F185后(SB)，蘿卜體內(nèi)鎘含量與對照S相比，不但沒有下降，反而顯著升高(P＜0.05)．同時(shí)接種2株融合菌，蘿卜體內(nèi)鎘含量與對照相比也有所提高，但差異不顯著(P＞0.05)．這可能是由于加了微生物，改變了土壤生境，促進(jìn)蘿卜的生長，提高了植物的吸收，導(dǎo)致蘿卜體內(nèi)鎘含量的升高．另外，在高濃度鎘脅迫下，沒有添加有效的營養(yǎng)，無論是外來微生物還是土著微生物都不能得到快速繁殖，不能發(fā)揮微生物對重金屬的固定作用．Reddy等[12]研究發(fā)現(xiàn)在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的土壤中，生物強(qiáng)化處理技術(shù)的效率由于微生物的生長受到抑制而大大降低．

圖4 各處理中蘿卜體內(nèi)的鎘含量及生物量Fig.4 Biomass and Cd concentrations in raddish grown in Cd-contaminated soil of different treatments

在添加諾沃肥的土壤中(SN)，蘿卜體內(nèi)的鎘含量與對照組相比，顯著降低(P＜0.05)．諾沃肥自身對Cd有很強(qiáng)的吸附能力．諾沃肥含有大量的羥基、羰基和羧基、豐富的有機(jī)質(zhì)以及石灰，這些基團(tuán)在固定鎘的過程中起到了重要作用[13-14]．

同時(shí)添加諾沃肥和融合菌的生物強(qiáng)化處理中，蘿卜體內(nèi)的鎘含量進(jìn)一步下降，其中接種F178的生物強(qiáng)化處理，蘿卜體內(nèi)鎘降低至0.3,mg/kg；接種F185處理中，蘿卜體內(nèi)的鎘降低至0.4,mg/kg；同時(shí)接種2株菌，蘿卜體內(nèi)的鎘含量最低，其值為0.17,mg/kg，達(dá)到了FAO/WHO食品安全質(zhì)量限量標(biāo)準(zhǔn)0.2,mg/kg．實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，在添加諾沃肥的土壤中，過氧化氫酶和脲酶活性顯著高于對照組，土壤微生物量顯著高于未施加諾沃肥只接種微生物的土壤[7]，這就說明諾沃肥可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)微生物增長，保障微生物修復(fù)效果．

表1 供試土壤和諾沃肥的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of soil and NovoGro

在SB處理中，蘿卜生物量雖有所升高，但是與對照相比，差異不顯著(P＞0.05)．而SN和SNB處理，蘿卜的生物量與對照相比顯著提高．在SNB中，同時(shí)接種2株融合菌，蘿卜的生物量最高，為4.04,g，比對照提高了91%．另外，在3個(gè)生物強(qiáng)化處理中，蘿卜的生物量與蘿卜體內(nèi)的鎘含量呈負(fù)相關(guān)．這說明加入融合菌的微生物強(qiáng)化技術(shù)可對植物的生長和重金屬的固定起到協(xié)同作用．

同時(shí)接種2株融合菌，比單獨(dú)接種1株處理效果更好，不僅能降低蘿卜體內(nèi)鎘含量，還能促進(jìn)蘿卜生長．關(guān)于同時(shí)接種2種微生物來提高對污染物處理效果的研究已有相關(guān)報(bào)道，Thompson等[15]建議采用生態(tài)理論來設(shè)計(jì)生物強(qiáng)化策略．增加表型不一致的功能群體的數(shù)量，可能導(dǎo)致補(bǔ)償性的再生，使生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定[16-17]．因此，在生物強(qiáng)化系統(tǒng)中接種一系列功能相似的菌種，有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定性．首先，應(yīng)確定接種的微生物是否有相似的功能，因?yàn)楣δ芟喈惖奈⑸飼?huì)發(fā)生激烈的競爭作用，導(dǎo)致生物強(qiáng)化系統(tǒng)運(yùn)行的失?。甁iang等[18]在生物強(qiáng)化系統(tǒng)中接種2種功能性相似的菌株，研究處理酚的效果，結(jié)果表明2種菌株即使存在微弱競爭，但是發(fā)揮相同的功能，降解酚的效果良好．事實(shí)上，有些菌株雖然某些情況下對生態(tài)系統(tǒng)是多余的，但是在特定的時(shí)間內(nèi)可能會(huì)應(yīng)對環(huán)境的變化，對生態(tài)系統(tǒng)的維持起到緩沖作用[16-19]，因此接種多種不同特征的微生物可能比單一微生物對生物強(qiáng)化更有效[20]．

3 結(jié) 論

本文利用基因組改組技術(shù)構(gòu)建對鎘有高耐受性的工程菌，并將所獲得的工程菌用于鎘污染土壤的修復(fù)．得到如下結(jié)論．

(1) 實(shí)驗(yàn)證明基因組改組技術(shù)可以被用來構(gòu)造高效抗鎘微生物，通過3輪基因組改組后共獲取2株抗鎘融合菌，鎘對這2種融合菌的最小抑制濃度分別為4.0,mmol/L和4.2,mmol/L，比出發(fā)6株突變菌有顯著提高．

(2) 在生物修復(fù)鎘污染土壤的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在添加諾沃肥后，分別接種這2種融合菌的生物強(qiáng)化處理可以顯著降低蘿卜體內(nèi)的鎘濃度，促進(jìn)蘿卜生長．同時(shí)利用F178和F185進(jìn)行生物強(qiáng)化處理時(shí)，效果更好．

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Breeding Cadmium-Resistant Strains by Genome Shuffling and Bioremediation of Cadmium Contaminated Soil

JIANG Chun-xiao1,2，WANG Ting1，ZHANG Yan-feng1，SUN Hong-wen1
(1. MOE Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria，College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Tianjin 300071，China；2. Environmental Engineering Design Institute Company Limited，Guangzhou 510115，China)

In order to acquire microorganism species with greater capacity to fix heavy metal pollutants in soil，genome shuffling technology was for the first time applied for cultivating strains with high cadmium (Cd)-resistance and accumulation potential. After three rounds of shuffling，two fused strains named F178 and F185 were obtained，whose minimum inhibition concentration (MIC) to cadmium was 4.0 mmol/L and 4.2 mmol/L，respectively，much higher than the MIC of the six original strains (0.08—0.25 mmol/L). The bioremediation effects of the two fused species were checked by pot experiment spiked with Cd concentration of (10 ± 0.4) mg/kg. NovoGro，a fertilizer made from the waste of an enzyme producer，was simultaneously added to support the activity of the organisms in soil. Results of the bioaugmentation experiment show that single inoculation with strain F178 and strain F185 reduces Cd concentration in the root tissue of radish to 0.3 mg/kg and 0.4 mg/kg, respectively, while Cd concentration in the control is 2.24 mg/kg. The biomass of radish is significantly improved，nearly 2 times that of the control. When coinoculated with strain F178 and strain F185，the concentration of Cd in the root tissue of radish is further reduced to 0.17 mg/kg，meeting the FAO/WHO food safety standards (0.2 mg/kg).

heavy metal；soil；protoplast fusion；bioremediation

X53

A

0493-2137(2012)07-0609-06

2011-04-27；

2011-08-15.

天津市農(nóng)委科技合作項(xiàng)目(0604130）.

姜春曉（1979— ），男，博士，高級(jí)工程師，jiangchunxiao@mail.nankai.edu.cn.

孫紅文，sunhongwen@nankai.edu.cn.