王春霞,王東巖,王雅青,許娜,徐軍,孫遠(yuǎn)征

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頭穴叢刺法對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬VEGF表達(dá)的影響

王春霞1,王東巖1,王雅青2,許娜2,徐軍2,孫遠(yuǎn)征1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

觀(guān)察頭穴叢刺方法對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能和VEGF表達(dá)的影響。40只大鼠采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法(2VO)制備慢性腦缺血模型,造模成功的大鼠分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)和頭穴叢刺組(C組)和尼莫地平組(D組)。C組采用頭穴叢刺法,D組行尼莫地平灌胃,A組和B組不予治療。治療結(jié)束后采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能;光鏡下觀(guān)察海馬細(xì)胞形態(tài)變化;免疫組化檢測(cè)海馬VEGF蛋白表達(dá)。術(shù)后8星期B、C、D組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),與A組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);C組和D組與B組相比,逃避潛伏期縮短(＜0.05)。HE染色C組和D組變性、死亡神經(jīng)細(xì)胞較B組明顯減輕。免疫組化A組偶見(jiàn)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),B、C、D組均可見(jiàn)VEGF蛋白表達(dá)增高,與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);C組和D組較B組表達(dá)升高(＜0.05)。頭穴叢刺能夠明顯改善大鼠的認(rèn)知功能,其可能通過(guò)上調(diào)VEGF蛋白表達(dá),從而對(duì)慢性腦缺血后新生血管的形成具有促進(jìn)作用,對(duì)神經(jīng)元恢復(fù)具有重要的意義。

頭針;腦缺血;認(rèn)知功能;海馬;VEGF

慢性腦缺血是各種原因引發(fā)的長(zhǎng)期慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的以持久或進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的一組疾病,發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn),最終導(dǎo)致持久或進(jìn)展性認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙[1],是血管性癡呆、Alzheimer病和Binswanger病等多種疾病的共同病理基礎(chǔ)。隨著人口的老齡化,慢性腦缺血發(fā)病率越來(lái)越高,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。慢性腦缺血與急性腦缺血不同,它有較長(zhǎng)的臨床前期可供干預(yù),多年來(lái)大量研究者一直致力于腦缺血后認(rèn)知功能障礙的防治研究,尋找有效的防治方法具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察頭穴叢刺對(duì)慢性腦缺血損傷大鼠認(rèn)知功能和海馬VEGF表達(dá)的影響,揭示頭穴叢刺治療慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制,為臨床上應(yīng)用頭穴叢刺法治療慢性腦缺血患者提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用健康雄性Wistar大鼠40只(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重(180±30)g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期,采用Morris水迷宮訓(xùn)練5 d,剔除游泳能力差的大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)8只和手術(shù)組32只,手術(shù)組死亡5只。手術(shù)后4星期再通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,造模成功的大鼠分為模型組(B組)、頭穴叢刺組(C組)和尼莫地平組(D組),每組9只。

1.2 模型制備

參照Sarti等[2]改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法(2VO)制備慢性腦缺血大鼠模型。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,保證手術(shù)期間有自主呼吸,取頸前部正中切口,鈍性分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)后結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈,逐層縫合,1星期后按照上面同樣步驟結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈后完成模型制作。假手術(shù)組僅分離暴露雙側(cè)CCA而不結(jié)扎。術(shù)后每日肌肉注射青霉素20萬(wàn)U/kg體重,預(yù)防感染,連續(xù)4 d。

1.3 治療方法

模型組不予任何治療。頭穴叢刺組于術(shù)后第5星期開(kāi)始針刺治療,參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取大鼠的百會(huì)和百會(huì)左右旁開(kāi)2 mm三個(gè)穴位,大鼠頭頂部常規(guī)剪毛消毒,用0.35 mm×25 mm毫針從后向前平刺6～8 mm,留針30 min,每15 min捻針1次,頻率為每分鐘200轉(zhuǎn),每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min,每日1次,共治療4星期。尼莫地平組于術(shù)后第5星期開(kāi)始灌胃治療,每20 mg尼莫地平溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100 mL配成0.02%懸浮液,按1 mg/kg灌胃,每日1次,與頭針組同一時(shí)段進(jìn)行,連續(xù)治療4星期。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

Morris水迷宮由圓形水池、自動(dòng)攝像機(jī)及電腦分析系統(tǒng)組成。數(shù)據(jù)的采集及圖像分析均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

水迷宮試驗(yàn)以搜索持續(xù)時(shí)間(逃避潛伏期)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間越長(zhǎng)說(shuō)明其學(xué)習(xí)記憶能力越差。

1.5 標(biāo)本的采集

各組大鼠造模后8星期以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射,麻醉生效后仰臥位固定,快速剪開(kāi)胸腹腔,清晰暴露心臟和主動(dòng)脈弓,剪開(kāi)右心耳,速將輸液器針頭自心尖處通過(guò)左心室插入主動(dòng)脈,快速灌注0.9%生理鹽水約200 mL,待液體從右心耳流出變清亮?xí)r,換用含4%多聚甲醛的0.1 MPBS(pH7.4)緩沖液200 mL進(jìn)行灌注固定,斷頭取腦,取以視交叉為中心相當(dāng)于前聯(lián)合連續(xù)腦片繼續(xù)固定4～6 h。常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋,用切片機(jī)切成5mm薄片,貼于載玻片上。將做好的石蠟切片放置在56℃烤箱中烘烤2 h,使石蠟切片和載玻片緊密粘附,防止脫片。存放于干燥避光處用于HE染色及免疫組化染色檢測(cè)。

1.6 免疫組化染色及結(jié)果判定

免疫組化染色采用SP法,兔抗鼠VEGF抗體由武漢博士德公司提供。細(xì)胞質(zhì)、胞漿內(nèi)粉紅色至棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá),應(yīng)用人工計(jì)數(shù)法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率,每張切片選取3個(gè)400×鏡下視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),以單個(gè)標(biāo)本為單位,取平均值,最后統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,組內(nèi)均數(shù)比較采用配對(duì)檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,方差齊之后采用檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較,＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能的檢測(cè)

術(shù)后8星期模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),與假手術(shù)組相比具有顯著性差異(＜0.05),大鼠的認(rèn)知功能明顯減退;頭穴叢刺組和尼莫地平組與模型組相比,逃避潛伏期明顯縮短(＜0.05),說(shuō)明大鼠的認(rèn)知功能有所改善。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

2.2 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化,海馬4至多層錐體細(xì)胞排列整齊、緊密,細(xì)胞核大而圓,核仁清晰,HE染色均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,輪廓清晰。模型組錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少,由4至多層減至2層,且層次不清,細(xì)胞排列稀疏,神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重變形,核固縮,胞漿消失,染色不均,有空泡形成,核仁顯示不清晰。頭穴叢刺組海馬細(xì)胞3至4層,排列層次及細(xì)胞形態(tài)清晰,胞質(zhì)染色均勻色淺,少見(jiàn)固縮錐體細(xì)胞。尼莫地平組海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)目較多,3層左右,層次較清晰,細(xì)胞形態(tài)尚規(guī)則,細(xì)胞邊緣清晰,少見(jiàn)固縮椎體細(xì)胞。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)HE染色

2.3 免疫組化檢測(cè)VEGF結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示,VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)胞漿呈粉紅色至棕黃色。假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)分布正常,VEGF蛋白呈少量表達(dá)。模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組可見(jiàn)VEGF表達(dá)增高,與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),而頭穴叢刺組和尼莫地平組較模型組表達(dá)更高(＜0.05)。詳見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬VEGF陽(yáng)性表達(dá)比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

圖2 各組大鼠海馬VEGF 蛋白表達(dá)(箭頭示VEGF 表達(dá))

3 討論

大量研究表明缺血性腦損傷的病理機(jī)制非常復(fù)雜,有多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)參與,是一個(gè)多基因和多靶點(diǎn)參與的過(guò)程。孫莉等[3]發(fā)現(xiàn),大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后1個(gè)月時(shí)額、顳葉等皮質(zhì)及海馬區(qū)以錐體細(xì)胞缺血改變?yōu)橹?皮質(zhì)下白質(zhì)可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生。隨后的2～4個(gè)月內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殄F體細(xì)胞凝固性壞死、變性、脫失,膠質(zhì)細(xì)胞增生及小血管的增生,并且海馬區(qū)以CA1區(qū)改變最為明顯。張海寧等[4]通過(guò)對(duì)電鏡下脂褐素和暗神經(jīng)元改變的研究,認(rèn)為慢性腦缺血初期腦損傷是可逆的,電鏡下1個(gè)月或更早可能是可逆損傷的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。有研究認(rèn)為結(jié)扎后3星期為慢性缺血期。楊宇等[5]在研究中發(fā)現(xiàn),慢性缺氧使實(shí)驗(yàn)組大鼠的空間定位記憶能力受到嚴(yán)重?fù)p害,對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)具有明顯的破壞作用?？梢?jiàn),海馬是腦缺血最為敏感的部位,與認(rèn)知功能有密切的關(guān)系,是學(xué)習(xí)和記憶的重要部位,因此我們選擇大鼠海馬作為研究對(duì)象。

慢性腦缺血發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn),屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇。腦為髓海,元神之府,神機(jī)之源。人的精神、記憶、思維等障礙皆與腦相關(guān),因此,本病病位在腦已形成共識(shí)。頭為“諸陽(yáng)之會(huì)”、“清陽(yáng)之腑”,五臟之精血、六腑之清氣,皆上注于腦,所以治療重點(diǎn)應(yīng)該針對(duì)腦腑,以腦局部取穴為主,使針感直達(dá)病所。頭穴叢刺法是針灸專(zhuān)家于致順教授根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)知識(shí)提出來(lái)的,以在頭部相應(yīng)治療區(qū)進(jìn)行“叢式”針刺,并以間斷行針為特點(diǎn)的頭穴針刺方法。這樣的針刺方法從針刺部位上來(lái)說(shuō),使對(duì)頭部的刺激由原來(lái)點(diǎn)狀刺激或線(xiàn)狀刺激擴(kuò)展到了面狀刺激,增加了針刺的刺激面積。從另一角度來(lái)講,在施用相同的針刺手法情況下,增加刺激面積,也就是增加了刺激量。這是頭穴叢刺法優(yōu)于其他頭針療法的一個(gè)重要特點(diǎn)。王利春等[6]認(rèn)為頭穴叢刺能通過(guò)增加腦血流量,改善微循環(huán),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝,使腦神經(jīng)細(xì)胞機(jī)能再恢復(fù),從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶功能。

一般認(rèn)為,Ca2＋內(nèi)流是細(xì)胞死亡的最后途徑。尼莫地平脂溶性很高,是慢通道電壓依賴(lài)性Ca2＋拮抗劑,對(duì)中樞神經(jīng)有特殊選擇作用,既能減輕Ca2＋超載引起的腦水腫和繼發(fā)性損害[7],也可以擴(kuò)張腦血管增加腦血流量,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[8]。有研究表明尼莫地平可減輕大鼠慢性腦缺血造成的自由基損傷和行為學(xué)障礙[9],也有臨床試驗(yàn)證實(shí)尼莫地平可改善認(rèn)知功能[10-11]。故我們選取尼莫地平作為對(duì)照藥物。

本研究應(yīng)用頭穴叢刺法與尼莫地平藥物對(duì)照治療慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙大鼠,并觀(guān)察對(duì)大鼠認(rèn)知功能和VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果術(shù)后8星期模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),與假手術(shù)組相比差異顯著(＜0.05),說(shuō)明術(shù)后大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙,而頭穴叢刺組和尼莫地平組與模型組相比,逃避潛伏期有明顯縮短(＜0.05),說(shuō)明大鼠認(rèn)知功能有所改善。免疫組化結(jié)果顯示假手術(shù)組偶見(jiàn)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),模型組、針刺組和藥物組均可見(jiàn)VEGF蛋白表達(dá)增高,與假手術(shù)組比較差異顯著(＜0.01);針刺組和藥物組較模型組表達(dá)更高(＜0.01)。

實(shí)驗(yàn)中,術(shù)后8星期,假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)偶見(jiàn)VEGF蛋白表達(dá),模型組大鼠可見(jiàn)VEGF表達(dá)明顯增加,表明慢性腦缺血后VEGF蛋白反應(yīng)性增加,進(jìn)而促使新生血管形成,而血管形成又是局部組織代謝和功能恢復(fù)所必需的,有重要的神經(jīng)保護(hù)作用,這可能是慢性腦缺血大鼠對(duì)缺血的一種代償性反應(yīng);而且頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠海馬VEGF蛋白表達(dá)比模型組更多,這說(shuō)明頭穴叢刺和尼莫地平均能促進(jìn)VEGF蛋白的分泌,因而推論其對(duì)慢性腦缺血后新生血管的形成有促進(jìn)作用,對(duì)神經(jīng)元的恢復(fù)有重要作用。頭穴叢刺可通過(guò)調(diào)整顱內(nèi)外血管舒縮功能,改善局部微循環(huán)障礙,促進(jìn)大腦血液循環(huán),提高腦組織的含氧量,加強(qiáng)腦細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng),改善皮層抑制狀態(tài),促進(jìn)腦組織的修復(fù),激活受損神經(jīng)細(xì)胞的功能,調(diào)動(dòng)正常腦細(xì)胞的潛在功能儲(chǔ)備,從而加強(qiáng)腦功能的代償作用,達(dá)到治療疾病的目的,并且長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)不良反應(yīng)。針灸由于其可以通過(guò)多系統(tǒng)、多水平、多層次、多途徑、多靶點(diǎn)綜合作用于慢性腦缺血多個(gè)病理環(huán)節(jié),有從整體上有效改善慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙的前景。

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Effect of Cluster Needling at Scalp Points on Hippocampal VEGF Expression in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

-1,-1,-2,2,2,-1.

1.Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040,China

To investigate the effect of cluster needling at scalp points on cognitive function and hippocampal VEGF expression in rats with chronic cerebral ischemia.Forty rats were used to make a model of chronic cerebral ischemia by modified permanent bilateral common carotid artery ligation. The rat models were assigned to sham operation group (group A), model group (group B), scalp point cluster needling group (group C) and nimodipine group (group D). Group Creceived cluster needling at scalp points and group D, nimodipine gavage. Groups A and B were not treated. After the end of treatment, rat cognitive function was assessed using a Morris water maze. Hippocampal cell forms were observed by light microscopy. Hippocampal VEGF protein expression was examined by an immunohistochemical method.At 8 weeks after operation, the escape latency lengthened significantly in groups B, C and D; there was a statistically significant difference compared with group A (＜0.05). The escape latency shortened in groups C and D compared with group B (＜0.05). HE staining showed that neuronal degeneration and necrosis abated significantly in groups C and D compared with group B. The immunohistochemical examination showed that VEGF expression-positive cells occasionally appeared in group A. VEGF protein expression increased in groups B, C and D; there was a statistically significant difference compared with group A (＜0.05). The expression increased in groups C and D compared with group B (＜0.05).Cluster needling at scalp points can significantly improve rat cognitive function. It promotes post-chronic cerebral ischemia formation of new blood vessels probably by up-regulation of VEGF protein expression, which is of important significance for neuronal recovery.

Scalp acupuncture; Cerebral ischemia; Cognitive function; Hippocampus; VEGF

1005-0957(2012)08-0609-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.08.609

2012-02-20

王春霞(1979 - ),女,主治醫(yī)師

孫遠(yuǎn)征(1957 - ),男,主任醫(yī)師,研究方向?yàn)獒標(biāo)幗Y(jié)合防治老年性疾病,E-mail:sunyuanzheng@163.com