頭穴叢刺對(duì)AD大鼠cAMP-PKAc-CREB及膽堿能的影響*

李虹霖,徐 飛,夏昆鵬,張 淼△,王玉玨

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

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頭穴叢刺對(duì)AD大鼠cAMP-PKAc-CREB及膽堿能的影響*

李虹霖1,徐 飛2,夏昆鵬1,張 淼1△,王玉玨1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

觀察頭穴叢刺對(duì)AD大鼠cAMP、PKAc、CREB及血清Ache、CHAT含量的影響。方法: 采用Aβ1-42雙側(cè)海馬區(qū)注射建立AD大鼠模型，隨機(jī)將大鼠分為空白組、模型組、頭穴叢刺組、傳統(tǒng)頭針組和體針組。每組各12只，通過(guò)westernblot及放免法觀察大鼠海馬區(qū)cAMP、PKAc、p-CREB/CREB的變化，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)測(cè)定血清Ache、CHAT含量。結(jié)果：各治療組與模型組相比cAMP、P-CREB/CREB、PKAc/β-action表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)，cAMP水平上：體針組與頭穴叢刺組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在p-CREB/CREB水平上：體針組與頭穴叢刺組相比具有顯著性差異(P<0.05)，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在PKA/β-actin水平上：傳統(tǒng)頭針組、體針組與頭穴叢刺組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。頭穴叢刺組、傳統(tǒng)頭穴組、體針組與模型組相比(P<0.05)，Ache、CHAT表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ache水平上：體針組與頭穴叢刺組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有下降趨勢(shì)，但(P>0.05)，兩者比較無(wú)顯著性差異，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較(P>0.05)，兩者比較無(wú)顯著性差異；在CHAT水平上：體針組與頭穴叢刺組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比(P<0.05)，兩者比較有顯著性差異，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較(P>0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:頭穴叢刺可以提高cAMP、PKAc、p-CREB/CREB水平，明顯降低血清中AchE的活性，增強(qiáng)ChAT的活性，進(jìn)而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

頭穴;叢刺;cAMP;PKAc;CREB；膽堿能

阿爾茨海默病(AD)是一種多發(fā)生在老年前期或老年期，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為學(xué)損害為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變。筆者既往通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，頭穴叢刺療法能夠提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[1]。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察其對(duì)AD大鼠海馬區(qū)cAMP、PKAc、CREB的影響及血清Ache、CHAT含量，揭示頭穴叢刺療法對(duì)于大鼠學(xué)習(xí)記憶能力調(diào)控的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康雄性Wistar大鼠60只，每只250～300 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK( 黑) 2008001]，大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司),試劑淀粉樣蛋白片段(Aβ1-42)(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)注射于腹腔，麻醉大鼠。腦立體定位儀固定大鼠頭部。頭部顱頂區(qū)消毒后，將大鼠頭部上方皮膚沿中線剪開(kāi)2 cm，暴露顱骨，在雙側(cè)海馬區(qū)用注射Aβ1-42寡聚體5 μL，注射完畢后清創(chuàng)縫合消毒[2]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 隨機(jī)分為5組:空白組、模型組、頭穴叢刺組、傳統(tǒng)頭針組和體針組，每組各12只。

空白組:用等量生理鹽水代替Aβ1-42寡聚體注射于大鼠海馬區(qū)。

頭穴叢刺組:造模成功7天后給予治療，取神庭穴、百會(huì)穴、前頂穴及這三穴左、右側(cè)各旁開(kāi)5 mm處，用0.35 mm×15 mm毫針平刺2 mm，平補(bǔ)平瀉手法，捻轉(zhuǎn)1 min留針2 h，每日1次，6天為1個(gè)療程，間隔1天，共治療4個(gè)療程。

傳統(tǒng)頭針組:取百會(huì)、四神聰，用0.35 mm×15 mm毫針，平刺2 mm，平補(bǔ)平瀉手法，捻轉(zhuǎn)1 min后留針15 min。療程同上。

體針組:取雙側(cè)腎俞穴、足三里穴，用0.35 mm×15 mm毫針，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5 mm，足三里穴直刺10 mm，平補(bǔ)平瀉手法捻轉(zhuǎn)1 min后留針15 min。療程同上。

1.2.3 Western Blot印跡分析 取大鼠雙側(cè)海馬組織，剪碎，裂解，離心，取上清，測(cè)定蛋白含量，電泳分析，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，顯色。對(duì)蛋白帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，測(cè)得PKAc蛋白的半定量指標(biāo)及p-CREB/CREB相對(duì)比值。

1.2.4 放免法檢測(cè)海馬組織cAMP含量 將分離出的海馬組織，放入勻漿器中充分勻漿。加入2 ml無(wú)水乙醇沖洗勻漿器與勻漿液合并，混勻，靜置5 min后，3 500轉(zhuǎn)/min離心15 min后，取上清液，60℃烘箱中烘干，4℃保存，測(cè)得cAMP含量。

1.2.5 血清Ache、CHAT含量檢測(cè) 采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)進(jìn)行測(cè)定血清Ache、CHAT含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1示，各治療組與模型組相比cAMP、P-CREB/CREB、PKAc/β-action表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)，cAMP水平上：體針組與頭穴叢刺組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在p-CREB/CREB水平上：體針組與頭穴叢刺組相比具有顯著性差異(P<0.05)，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在PKAC/β-actin水平上：傳統(tǒng)頭針組、體針組與頭穴叢刺組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2示，頭穴叢刺組、傳統(tǒng)頭穴組、體針組與模型組相比(P<0.05)，Ache、CHAT表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ache水平上：體針組與頭穴叢刺組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比有下降趨勢(shì)，但(P>0.05)，兩者比較無(wú)顯著性差異，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較(P>0.05)，兩者比較無(wú)顯著性差異；在CHAT水平上：體針組與頭穴叢刺組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，頭穴叢刺組與傳統(tǒng)頭針組相比(P<0.05)，兩者比較有顯著性差異，體針組與傳統(tǒng)頭針組比較(P>0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組鼠腦組織中cAMP、p-CREB/CREB、PKAc/β-actin相對(duì)表達(dá)含量變化

注：與模型組比較,#P<0.05;與頭穴叢刺組比較，▲P<0.05;★P>0.05;與傳統(tǒng)頭針組比較,▼P<0.05，※P>0.05

表2 各組鼠腦組織中Ache、CHAT表達(dá)

注：與模型組比較，#P<0.05；與頭穴叢刺組比較,▲P<0.05;★P>0.05，與傳統(tǒng)頭針組比較,※P>0.05

3 討論

研究表明, cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)。cAMP作為細(xì)胞內(nèi)傳遞信息的第二信使，其含量的增加，可以促進(jìn)突觸前遞質(zhì)的釋放，將其注入感覺(jué)神經(jīng)元，可產(chǎn)生5-HT效應(yīng)，促使短時(shí)程的易化效應(yīng)，PKA是cAMP最主要的效應(yīng)分子，PKA的抑制劑能阻止其易化[3]。cAMP可以促進(jìn)與長(zhǎng)期記憶相關(guān)蛋白的合成，可加速即早基因表達(dá)[4]。研究證實(shí)，PKA參與LTP的形成。[5]。CREB的下游效應(yīng)與記憶的形成有關(guān)，作為核內(nèi)的“第三信使”, 推斷是對(duì)外部刺激產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程記憶的最適核轉(zhuǎn)錄因子[6-7]，在長(zhǎng)期記憶形成過(guò)程中起到重要的作用。研究表明，將CREB的反義寡核苷酸注入海馬組織時(shí)，導(dǎo)致其空間學(xué)習(xí)能力下降，而阻滯雙側(cè)穹窿海馬傘的大鼠，也可因海馬pCREB的水平下降而使其逃避性記憶能力損害[8]。磷酸化的CREB可影響神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)及突觸的可塑性，其活性與數(shù)量的變化能影響長(zhǎng)時(shí)程記憶的表達(dá)，形成長(zhǎng)時(shí)程記憶[9-10]。因此通過(guò)干預(yù)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路能影響AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。乙酰膽堿(Ach)是中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的特異神經(jīng)遞質(zhì)，ChAT是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志，亦是催化Ach生物合成的限速酶[11]。大量研究證明，AD患者乙酰膽堿合成減少，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性下降，與AD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12]。通過(guò)本課題的研究發(fā)現(xiàn)頭穴叢刺能夠激活cAMP，催化PKAc的釋放，強(qiáng)化CREB的表達(dá)，明顯降低AchE的活性，增強(qiáng)ChAT的活性，從而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，療效顯著。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Point Therapy on cAMP-PKAc-CREB and Cholinergic System of Alzheimer’s Disease Rats

LI Hong-lin1,XU Fei2,XIA Kun-peng1,ZHANG Miao1△，WANG Yu-jue1

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150001，China; 2.HeilongjiangProvincialHospital，Harbin150000，China)

Objective：To explore the effect of cluster needling of scalp point therapy on cAMP-PKAc-CREB of Alzheimer’s disease rats. Methods：Establish models with Alzheimer’s disease by injecting Aβ1-42oligomer into bilateral hippocampus.Sixty rats were randomized into five groups including blank control group,cluster needling of scalp point group,traditional head acupuncture group,body acupuncture group and model group.Observe the changes of cAMP,PKAc and p-CREB/CREB through western blot and radio-immunity method，and ELISA method was used to determine Ache,CHAT in blood.Results：It showed marked differences between each treatment group and the model group (P<0.05).As to the cAMP level:there was a statistical difference between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group(P<0.05);it showed a rising trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncture group,but no marked differences between two groups (P>0.05).As to the p-CREB/CREB level:it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed a rising trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncturegroup,but no marked differences between two groups(P>0.05);there was a statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P<0.05).As to the pkac/β-actin level:there were statistical differences among traditional head acupuncture group,body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);there were no marked differences between traditional head acupuncture group and body acupuncture group (P>0.05).As to the Ache：it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed a decreasing trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncturegroup,but no marked differences between two groups (P>0.05);there was no statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P>0.05).As to the CHAT：it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed marked differences between cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncture group (P<0.05);there was no statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P>0.05).Conclusion：The cluster needling of scalp point therapy can improve learning and memory function of Alzheimer’s disease rats by improving the levels of cAMP,PKAc and p-CREB/CREB，decreasing Ache activity and increasing CHAT activity.

Scalp point;Cluster needling;cAMP;PKAc;CREB；Cholinergic system

黑龍江省自然科學(xué)基金編號(hào)：H201476;黑龍江省博士后流動(dòng)站資助基金，編號(hào)：LBH-Z14199。

李虹霖(1981-),女，副主任醫(yī)師，中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)在站博士后，研究方向：針灸康復(fù)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

△通訊作者：張淼(1973-),女，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：針刺防治老年性疾病的基礎(chǔ)臨床研究。

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2016-03-31