蔣興娜,李衛(wèi)朋,張佑紅,朱雄偉,諶 頡,蘇騰甲

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

林可霉素[1]是由Mason等在1962年從鏈霉菌林可變種培養(yǎng)液中獲得的一類高效廣譜的抗生素.國(guó)內(nèi)林可霉素廠家發(fā)酵產(chǎn)物以林可霉素A為主，同時(shí)也含有林可霉素B、C、D等類似物.研究表明，林可霉素 A、B組分的分子結(jié)構(gòu)中僅相差一個(gè)CH2，物理化學(xué)性質(zhì)相似，但林可霉素B抗菌活力小，毒性大.因此，為提高林可霉素的藥效，減少藥物的毒副作用，需要對(duì)其進(jìn)行分離提純以獲得高純度的林可霉素.

我國(guó)各廠家所采用的林可霉素提煉工藝主要是溶劑萃取法，但此法存在工藝復(fù)雜、工序繁多、收率低、物耗及能耗高等缺點(diǎn)，故尋找出一種高效提高林可霉素A的純度的方法是至今亟待解決的問(wèn)題.分子印跡聚合物[2-7]是一種新型的分離材料，對(duì)目標(biāo)分子具有高親和性和選擇性，適用于結(jié)構(gòu)類似的化合物分離，特別是與色譜分析和分離[4-8]，固相萃取[9]等技術(shù)的結(jié)合已成為研究的熱點(diǎn).

本研究運(yùn)用分子印跡技術(shù)，首次以林可霉素A為模板分子，采用單步溶脹法[10-12]制備球形的分子印跡聚合物，并對(duì)其吸附性能進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研制出有效分離林可霉素各組分的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 苯乙烯；甲醇；冰醋酸；氯仿；偶氮二異丁腈；過(guò)二硫酸鉀；鄰苯二甲酸二丁酯；α-甲基丙烯酸；氯化鈉；十二烷基硫酸鈉；聚乙烯醇；乙二醇二甲基丙烯酸酯；鹽酸林可霉素.

1.1.2 儀器 JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀；JSM-5510LV掃描電子顯微鏡；馬爾文激光粒度分析儀；Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀；UV-1600紫外分光光度計(jì)；氮?dú)獯蹈蓛x；SXT-06索氏提取器；1260安捷倫高效液相色譜；DZF-6050真空干燥箱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TG18M高速離心機(jī)；恒溫振蕩器.

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜分析 稱取適量的林可霉素加入容量瓶中，用氯仿稀釋定容，配制濃度為4 mmol/L的溶液，固定該濃度，按1∶0、1∶2、1∶4、1∶6的比例加入功能單體MAA，25 ℃下振蕩24 h后，以相應(yīng)濃度的MAA氯仿溶液作為參比，測(cè)定林可霉素紫外吸收光譜的變化.

1.2.2 分子印跡聚合物烯微球的制備a.聚苯乙烯微球制備.將70 mL超純水、0.087 g氯化鈉、10 g苯乙烯單體加入錐形瓶中，室溫下水浴超聲分散40 min，然后將溶液轉(zhuǎn)入到四口瓶，通入氮?dú)?0 min后加入30 mL 2.5 mmol/L脫氧過(guò)硫酸鉀水溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70 ℃恒溫反應(yīng)20 h.反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將獲得的乳液用超純水反復(fù)離心洗滌干燥后重新分散到水中，配成0.2 g/mL的分散液.

b.林可霉素A分子印跡聚合物烯微球的制備.稱取0.406 g林可霉素溶解于5 mL氯仿中，加入0.34 g的甲基丙烯酸(MAA)、3.96 g乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、1.96 g鄰苯二甲酸二丁酯和0.2 g偶氮二異丁腈，溶解混合均勻后加入50 mL 0.1%(質(zhì)量比)十二烷基硫酸鈉和1.0%聚乙烯醇混合液，超聲分散均勻，加入2.0 mL聚苯乙烯微球分散液，25 ℃下以150 r/min速度攪拌溶脹20 h.通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，70 ℃反應(yīng)20 h.非印跡聚合物微球的制備方法與上述相同，只是在制備過(guò)程中沒(méi)有加入模板分子林可霉素A.

c.洗脫處理.將獲得的顆粒置于索氏提取器中，以甲醇∶冰醋酸(9∶1)為溶劑萃取24 h除去模板分子，再用甲醇繼續(xù)萃取5 h除去冰醋酸，最后用水洗去殘留的甲醇，20 ℃真空干燥至恒重.

1.2.3 紅外光譜分析 采用傅立葉紅外光譜儀對(duì)MIPMs、MAA、EDMA進(jìn)行光譜分析.

1.2.4 分子印跡聚合物微球的形貌及粒徑分析 采用掃描電鏡觀測(cè)MIPMs的形貌，并用粒度分析儀對(duì)微球的粒徑進(jìn)行分析.

1.2.5 林可霉素的含量檢測(cè) 吸附液中林可霉素的含量分析，采用高效液相色譜法.色譜條件：流動(dòng)相為0.05 mmol/L的四硼酸鈉水溶液(用濃鹽酸將pH值調(diào)至6)：甲醇(體積比6∶4)；色譜柱為Phenomenex C18柱(4.6 mm×100 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)UV為214 nm.

1.2.6 分子印跡聚合物微球的結(jié)合性能研究 為研究MIPMs對(duì)模板分子的結(jié)合特性，取50 mg MIPMs和NIPMs分別置于25 mL錐形瓶中，加入不同濃度的林可霉素氯仿溶液， 25 ℃下恒溫振蕩24 h，然后將其混合物用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，精密移取2 mL濾液用氮?dú)獯蹈?，甲醇稀釋定容，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定吸附前和吸附平衡后溶液中的林可霉素A的濃度.

利用式(1.1)計(jì)算單位質(zhì)量MIPMs和NIPMs對(duì)底物的吸附量Q：

(1.1)

式中，Q為分子印跡聚合物微球?qū)Φ孜锏奈搅?μmol/g)；C0為吸附前底物的初始濃度(mmol/L)；C為吸附后溶液中底物的濃度(mmol/L)；V為吸附液的體積(mL)；m為吸附劑的質(zhì)量(g).

為分析MIPMs對(duì)模板分子的識(shí)別特異性，稱取50 mg MIPMs和NIPMs分別置于25 mL錐形瓶中，加入10 mL 1 mol/L的林可霉素粗品氯仿溶液，按相同的方法測(cè)定其含量.

利用式(1.2)計(jì)算結(jié)合分配系數(shù)KD：

(1.2)

式中，Cp為分子印跡聚合物微球結(jié)合底物的濃度(μmol/g)；Cs為溶液中底物的平衡濃度(mmol/L).

利用式(1.3)計(jì)算分離因子α：

(1.3)

式中，α表示A，B兩種物質(zhì)的分離因子；KA表示A物質(zhì)在分子印跡聚合物微球吸附后的分配系數(shù)(mL/g);KB表B物質(zhì)在分子印跡聚合物微球吸附后的分配系數(shù)(mL/g).

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜研究模板分子與功能單體的作用力

紫外光譜分析模板分子林可霉素和功能單體MAA在氯仿中結(jié)合的情況.

圖1 林可霉素在不同濃度的MAA中的紫外吸收光譜Fig.1 UV adsorption of licomycin in the presence of different concentration of MAA m (lincomycin)/m 注：a) 1∶0; b) 1∶2; c) 1∶4; d):1∶6.

圖1中的a、b、c及d曲線分別為4 mmol/L的林可霉素在氯仿中按1∶0、1∶2、1∶4及1∶6的比例加入MAA后的紫外光譜的變化.由圖可知，隨著MAA濃度的增加，林可霉素的最大紫外吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，且波峰強(qiáng)度不斷降低，這可能是由于林可霉素羰基中的氧原子與MAA中羥基的氧原子產(chǎn)生了較強(qiáng)的相互作用，推測(cè)為O…H―O的氫鍵作用.

2.2 紅外光譜分析分子印跡聚合物微球的結(jié)構(gòu)

紅外光譜分析功能單體和交聯(lián)劑的共聚情況、以及模板分子與功能單體之間發(fā)生作用的功能基團(tuán).

圖2 MAA (a)、EDMA (b)及MIPMs (c)的紅外光譜圖Fig.2 IR of spectrum of MAA (a), EDMA (b) and MIPMs (c)

2.3 分子印跡聚合物微球的表觀形貌及粒徑

掃描電鏡觀察林可霉素A分子印跡聚合物微球的表觀形態(tài).

圖3 MIPMs的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM of MIPMs

由圖3可知，MIPMs雖然表面有些粗糙，但是粒度均勻，單分散性良好.同時(shí)經(jīng)激光粒度分析儀檢測(cè)，其平均粒徑為2.58 μm，基本符合色譜柱對(duì)微球粒徑的要求.

2.4 分子印跡聚合物微球的結(jié)合性能研究

2.4.1 MIPMs的結(jié)合特性 研究MIPMs的結(jié)合特性，在林可霉素A濃度0～3.5 mmol/L的范圍內(nèi)，測(cè)定MIPMs和NIPMs的結(jié)合等溫線.

圖4 MIPMS和NIPMs的結(jié)合等溫線Fig.4 Binding isotherm of MIPMs and NIPMs

圖4中的a和b分別為MIPMs和NIPMs對(duì)林可霉素A的結(jié)合等溫線.比較圖4中的a、b曲線可知，MIPMs對(duì)林可霉素A的結(jié)合量高于NIPMs的，說(shuō)明林可霉素A在MIPMs中留下的印跡孔穴及孔穴上的活性結(jié)合位點(diǎn)決定了MIPMs 對(duì)林可霉素A的親合力.

2.4.2 MIPMs的特異識(shí)別性能 選用林可霉素A的結(jié)構(gòu)類似物林可霉素B作為競(jìng)爭(zhēng)底物考察MIPMs的識(shí)別性能(表1).

表1 MIPMs與NIPMs對(duì)林可霉素A和林可霉素B的吸附性能Table 1 capabilities of MIPMs and NIPMs to lincomycin A and lAdsorptionincomycin B

由表1可知，MIPMs和NIPMs分別對(duì)林可霉素A和林可霉素B兩底物的吸附性能存在一定的差異.MIPMs對(duì)林可霉素A有一定的選擇吸附能力，其分離因子α為1.27.NIPMs對(duì)兩底物的吸附能力基本相當(dāng)，其分離因子α僅為1.02.這種差異表明，通過(guò)單步溶脹聚合法制得的MIPMs對(duì)模板分子具有識(shí)別性能.

4 結(jié) 論

以大粒徑的單分散聚苯乙烯微球?yàn)榉N球、林可霉素A為模板分子，采用單步溶脹聚合法制備林可霉素A的分子印跡聚合物微球.通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)的表征和識(shí)別性能的測(cè)定，表明該材料對(duì)林可霉素A具有一定的親和性和選擇性，對(duì)林可霉素A和林可霉素B的分離因子α為1.27，而非印跡聚合物微球的分離因子α僅為1.02.該分子印跡聚合物微球有望用于林可霉素粗品的分離、純化.

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