魏松紅， 張麗瑩， 王 黎， 張景遠(yuǎn)， 李 斐

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866）

化學(xué)除草劑的大量使用，對環(huán)境和人類的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅［1]，因此尋求更為安全有效的除草劑已成為除草劑產(chǎn)業(yè)今后的發(fā)展方向。近年來微生物源除草劑得到了較大的發(fā)展，從植物病原真菌中篩選具有除草活性的菌株是微生物源除草劑研究的一個(gè)很重要的方面［2]。

研究報(bào)道最多的產(chǎn)生除草活性毒素的植物病原真菌主要來自鏈格孢菌屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）等。強(qiáng)勝等［3]對百日草鏈格孢菌（Alternaria alternata）孢子大規(guī)模生產(chǎn)以及該菌產(chǎn)生的毒素進(jìn)行了提純和生測，該菌株產(chǎn)生的毒素對紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）有致病作用。張金林等［4]研究發(fā)現(xiàn)蔥葉枯病菌（Stemphylium botryosum）毒素對稗草（Echinochloa crusgalli）和馬唐（Digitaria sanguinalis）等雜草種子的萌發(fā)和幼苗生長有較強(qiáng)的抑制作用。董金皋等［5]從灰葡萄孢BC7－3菌株的代謝產(chǎn)物中得到了一個(gè)純度達(dá)99.38%對馬唐具有較強(qiáng)殺除活性的純組分。

本試驗(yàn)利用篩選到的對馬唐種子萌發(fā)具有抑制作用的小麥根腐病菌菌株，對該菌株搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌株進(jìn)行發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)，并為進(jìn)一步利用該菌株產(chǎn)生的除草活性物質(zhì)開發(fā)創(chuàng)制新農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試雜草、菌株和培養(yǎng)基

馬唐（Digitaria sanguinalis）采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。

小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，對馬唐種子萌發(fā)抑制率達(dá)到81.67%。

PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、Peberdy培養(yǎng)基、Richard培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基。

1.2 菌株培養(yǎng)濾液制備

將小麥根腐病菌菌株擴(kuò)繁，用直徑0.5cm的打孔器打取菌片，接種于250mL三角瓶中，每瓶裝有150mL PD培養(yǎng)液，每瓶接種3片，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)，7d后，用4層紗布過濾去掉菌絲體，再用定性濾紙（中速）過濾，得到無菌培養(yǎng)濾液。

1.3 供試菌株培養(yǎng)濾液除草活性測定

采用種子萌發(fā)法測定菌株的除草活性。將濾紙放入培養(yǎng)皿中，165℃干熱滅菌30min。在皿中放入待測雜草種子20粒，加入無菌培養(yǎng)濾液3mL，以清水做對照，重復(fù)3次，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，對照發(fā)芽率達(dá)到80%及以上時(shí)，記錄種子發(fā)芽數(shù)，并計(jì)算校正抑制率，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復(fù)級差法分析5%差異顯著性。

1.4 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

供試培養(yǎng)基選擇PDA、PSK、Peberdy培養(yǎng)基、Richard培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基。將篩選出的小麥根腐病菌分別接種于不同培養(yǎng)液中，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d后過濾，進(jìn)行除草活性測定。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗(yàn)

（1）碳源篩選：以篩選出的培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1 000mL培養(yǎng)液中分別加入20g葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、可溶性淀粉、乳糖作碳源，取代培養(yǎng)液中的碳源，每處理3次重復(fù)，以不加碳源的培養(yǎng)濾液為對照，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。（2）氮源篩選：在1 000mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，分別加入2.5g氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、酵母膏、硝酸銨、蛋白胨作為氮源，每處理3次重復(fù)，以不加氮源的培養(yǎng)濾液作為對照，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。（3）添加不同無機(jī)鹽：在1 000mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，分別加入 KCl 0.5g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，CuSO40.5g，MnCl20.5g，Zn－SO40.5g，每處理3次重復(fù)，以不加無機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為對照，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。

1.5.2 多因素正交試驗(yàn)

以篩選出的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽為變異因素，采用L18（37）正交表進(jìn)行培養(yǎng)基基本組成配比優(yōu)化試驗(yàn)，從中選出發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)基組合。

1.6 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

對小麥根腐病菌從初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量和接種量等方面進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化：（1）將發(fā)酵液初始pH 分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、11.0，28 ℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。（2）將小麥根腐病菌接種于察氏培養(yǎng) 液 中，分 別 放 在 靜 置、100、130、150、180、210r／min的條件下，28℃，培養(yǎng)5d，過濾。（3）將發(fā)酵培養(yǎng)液分別放置在20、24、28、32、36、40℃的搖床中，130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。（4）將小麥根腐病菌接種于察氏培養(yǎng)液中，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)，分別發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7、8、9、10d后過濾。（5）在250mL的三角瓶中分別裝入40、80、100、120、140、160、180mL發(fā)酵培養(yǎng)液，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。（6）取10mL無菌水沖洗平板上的小麥根腐病菌孢子，分別按培養(yǎng)液的0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、130r／min振蕩培養(yǎng)5d，過濾。

1.7 小麥根腐病菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)研究

對小麥根腐病菌發(fā)酵產(chǎn)物的理化性質(zhì)主要從以下方面進(jìn)行研究：

（1）熱穩(wěn)定性測定

試驗(yàn)設(shè)兩組處理，將培養(yǎng)濾液分別于30、50、70、90、121℃處理30min；將培養(yǎng)濾液在高壓滅菌條件下處理30、60、90min。待培養(yǎng)濾液自然冷卻后，用種子萌發(fā)法檢測除草活性。

（2）酸堿穩(wěn)定性測定

用1.0mol／L HCl和1.0mol／L NaOH 分別將培養(yǎng)濾液 pH 調(diào)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，常溫下 放置24h后，將pH調(diào)回原值，用種子萌發(fā)法檢測除草活性。

（3）光照穩(wěn)定性測定

將培養(yǎng)濾液置開蓋培養(yǎng)皿內(nèi)，分別在自然光和40W日光燈（距光源50cm）下照射3、6、12h后以種子萌發(fā)法檢測活性。

（4）紫外線穩(wěn)定性

將培養(yǎng)濾液置于15W紫外燈下照射15、30、45、60min后用種子萌發(fā)法檢測其活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

小麥根腐病菌在5種培養(yǎng)液中的培養(yǎng)濾液對馬唐種子均有抑制作用（圖1），其中小麥根腐病菌在察氏培養(yǎng)液中產(chǎn)生的活性物質(zhì)對馬唐種子的校正抑制率最高，達(dá)到86.67%。小麥根腐病菌在其他4種培養(yǎng)液中的培養(yǎng)濾液對馬唐種子的校正抑制率都低于80%，并且和察氏培養(yǎng)液具有顯著差異，所以察氏培養(yǎng)基是最適合小麥根腐病菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對小麥根腐病菌發(fā)酵液除草活性的影響

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.2.1 不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對小麥根腐病菌除草活性的影響

添加不同的碳源對小麥根腐病菌除草活性物質(zhì)的產(chǎn)生有一定的影響（圖2），以葡萄糖為碳源時(shí)校正抑制率最高，為86.67%。所以葡萄糖為適合小麥根腐病菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的碳源。

圖2 不同碳源對小麥根腐病菌發(fā)酵液除草活性的影響

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)液中添加的氮源為氯化銨時(shí)，小麥根腐病菌的發(fā)酵液對馬唐的校正抑制率達(dá)到88.33%，以硝酸銨為氮源時(shí)，校正抑制率達(dá)到83.33%，處理間差異不顯著。

圖3 不同氮源對小麥根腐病菌發(fā)酵液除草活性的影響

由圖4可知添加不同無機(jī)鹽的培養(yǎng)濾液均具有一定的除草活性，其中培養(yǎng)基中添加KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4校正抑制率分別達(dá)到91.67%、90.00%、90.00%、90.00%，處理間差異不顯著。

圖4 不同無機(jī)鹽對小麥根腐病菌菌株除草活性的影響

2.2.2 多因素正交試驗(yàn)

以葡萄糖、氯化銨、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸亞鐵為變量，按L18（37）設(shè)計(jì)7因素3水平正交試驗(yàn)。極差分析結(jié)果表明（表1、2、3），不同成分含量影響程度的R值：A＞C＞F＞G＞E＞B＞D，最佳水平組合為A2B2C2D3E3F1G1；方差分析結(jié)果表明因素A高度顯著，因素C顯著，因素B、D、E、F、G不顯著，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選B1、D1、E1、F1、G1，所以最優(yōu)水平組合為A2B1C2D1E1F1G1。

表1 培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分的正交試驗(yàn)因素與水平

表2 培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分的正交試驗(yàn)結(jié)果1）

2.3 不同發(fā)酵條件對小麥根腐病菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物除草活性的影響

由圖5可知，小麥根腐病菌在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下產(chǎn)生除草活性物質(zhì)的量很少，對馬唐種子萌發(fā)的校正抑制率低。pH由強(qiáng)酸強(qiáng)堿性向中性變化時(shí)，校正抑制率逐漸提高，當(dāng)初始培養(yǎng)液pH為7時(shí)，校正抑制率達(dá)到最高為93.33%。

表3 培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分的方差分析結(jié)果1）

圖5 不同初始pH對小麥根腐病菌發(fā)酵液除草活性的影響

小麥根腐病菌在靜置條件下的發(fā)酵液對馬唐的校正抑制率最低，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下，隨著轉(zhuǎn)速的提高，校正抑制率有所提升，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到130r／min時(shí)，校正抑制率最高為93.33%，轉(zhuǎn)速高于130r／min時(shí)，校正抑制率下降（圖6）。

圖6 不同轉(zhuǎn)速對小麥根腐病菌發(fā)酵液除草活性的影響

由圖7可知，隨著溫度的升高，小麥根腐病菌菌株除草活性物質(zhì)產(chǎn)量不斷增加，28℃時(shí)其發(fā)酵液對馬唐種子萌發(fā)的校正抑制率達(dá)到95%，當(dāng)溫度高于28℃時(shí)，菌絲的生長速度明顯下降。

由圖8可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，小麥根腐病菌除草活性物質(zhì)產(chǎn)量逐漸增加，5d時(shí)產(chǎn)量達(dá)到高峰，發(fā)酵液對馬唐種子萌發(fā)的校正抑制率達(dá)到96.67%，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過5d時(shí)，菌株的除草活性下降。

不同裝液量對小麥根腐病菌除草活性有一定的影響（圖9），裝液量為120mL／250mL時(shí)，校正抑制率達(dá)到最高為93.33%，裝液量再增加時(shí)，校正抑制率反而下降。

由圖10可知，接種量對小麥根腐病菌除草活性物質(zhì)的產(chǎn)量有一定的影響，隨著接種量的增加，培養(yǎng)濾液活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)接種量為6%時(shí)，校正抑制率達(dá)到95.00%。

2.4 小麥根腐病菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)研究

（1）熱穩(wěn)定性測定

將培養(yǎng)濾液分別于30、50、70、90、121℃處理30min后，培養(yǎng)濾液對馬唐種子萌發(fā)的抑制率分別為93.33%、95%、93.33%、96.67%、93.33%，但在121℃下處理60、90min后，培養(yǎng)濾液的抑制率下降到80%和68.33%（表4），說明培養(yǎng)濾液中的活性物質(zhì)對溫度有一定的穩(wěn)定性，但長時(shí)間的高溫處理，會(huì)破壞培養(yǎng)濾液中的活性物質(zhì)。

表4 小麥根腐病菌菌株培養(yǎng)濾液的熱穩(wěn)定性1）

（2）酸堿穩(wěn)定性測定

培養(yǎng)濾液在pH5～7的范圍內(nèi)變化時(shí)，其對馬唐種子的抑制率在90%以上，各處理和對照差異不顯著，pH為堿性時(shí)，抑制率有所下降，可見培養(yǎng)濾液在弱酸性和中性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定（圖11）。

（3）光照穩(wěn)定性測定

小麥根腐病菌培養(yǎng)濾液在自然光和日光燈下分別照射，由圖12可知不同光照下菌株除草活性沒有顯著差異，說明該病菌的培養(yǎng)濾液具有很好的光照穩(wěn)定性。

圖11 小麥根腐病菌菌株培養(yǎng)濾液的酸堿穩(wěn)定性

圖12 小麥根腐病菌菌株培養(yǎng)濾液的光照穩(wěn)定性

（4）紫外線穩(wěn)定性

培養(yǎng)濾液放在紫外燈下分別照射15、30min時(shí)，其對馬唐種子萌發(fā)的抑制率和對照差異不顯著，照射45、60min時(shí)抑制率下降到80%和78.33%，所以培養(yǎng)濾液在儲藏過程中要避免紫外照射（圖13）。

圖13 小麥根腐病菌菌株培養(yǎng)濾液的紫外穩(wěn)定性

3 討論

微生物能產(chǎn)生很多代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物中含有殺草活性物質(zhì)，利用微生物所產(chǎn)生的對植物具有毒性的代謝產(chǎn)物進(jìn)行雜草防除的除草劑稱為微生物源除草劑［7]。第一個(gè)開發(fā)成功的微生物源除草劑為雙丙氨膦，廣泛用于防除一年生和多年生禾本科雜草及闊葉雜草。姜述君［8]等從狹卵鏈格孢菌株AAEC0523中分離到一淡黃色的油狀毒素，對稗草的種子萌發(fā)和幼苗生長都有較強(qiáng)的抑制作用。谷祖敏［9]等從草莖點(diǎn)霉SYAU－06菌株中提取的毒素對鴨跖草胚根和芽的伸長有較強(qiáng)的抑制作用。

發(fā)酵是抗生素產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，若缺乏合理的發(fā)酵工藝，也不能將其潛力充分發(fā)揮，抗生素發(fā)酵除受營養(yǎng)因素的限制以外，合適的發(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素［10－11]。為了提高小麥根腐病菌發(fā)酵液活性物質(zhì)的產(chǎn)量，本研究通過單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對其發(fā)酵培養(yǎng)基成分及搖床發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期得到最利于產(chǎn)生除草活性物質(zhì)的發(fā)酵條件。本試驗(yàn)得出的最佳碳源為葡萄糖，最適初始pH 7.0?？到B蘭等［12]的研究表明，最適合小麥根腐病菌菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)的碳源是淀粉，最適pH為4.0，這可能是因?yàn)槲⑸锏拇渭壌x產(chǎn)物具有菌株特異性，且不同的發(fā)酵培養(yǎng)基配方或條件誘導(dǎo)不同的次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生［13]。本試驗(yàn)對于培養(yǎng)基配方對菌株活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，提高了工作效率和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，后續(xù)試驗(yàn)可對發(fā)酵濾液中的活性物質(zhì)進(jìn)行提取，以達(dá)到更好的效果。

［1]Li Y Q，Sun Z L，Zhuang X F，et al.Research progress on microbial herbicides［J].Crop Protection，2003，22（2）：247－252.

［2]Charudattan R，Dinoor A.Biological control of weeds using plant pathogens：accomplishments and limitations［J].Crop Protection，2000，19（8－10）：691－695.

［3]強(qiáng)勝，郭愛民，李揚(yáng)漢.大批量生產(chǎn)百日草鏈格孢菌孢子的技術(shù)［J].中國生物防治，1997，13（4）：169－172.

［4]張金林，董金皋，樊慕貞，等.蔥葉枯病菌Stemphylium botryosum 毒素的分離與除草活性研究［J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3（2）：60－66.

［5]鄭蒙，徐擴(kuò)，董金皋.灰葡萄孢BC7－3菌株除草活性組分的純化與結(jié)構(gòu)鑒定［J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（10）：1362－1366.

［6]Zhang J L，Zhang L H，Liu Y C，et al.The herbicidal activity of mutant isolates from Botrytis cinerea［J].Agricultural Sciences in China，2006，5（8）：622－628.

［7]孫巍，張蕾，吳迪，等.微生物除草劑的研究進(jìn)展與展望［J].微生物學(xué)雜志，2006，26（2）：88－91.

［8]姜述君，范文艷，鞠世杰，等.狹卵鏈格孢菌株AAEC0523及毒素對稗草的致病性［J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（3）：283－288.

［9]谷祖敏，紀(jì)明山，張楊，等.草莖點(diǎn)酶粗毒素的除草活性和殺草譜研究［J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（4）：431－434.

［10]魏松紅，付丹妮，逄若霖，等.除草活性放線菌DN5發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)的研究［J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（2）：246－253.

［11]Saudagar P S，Singhal R S.Optimization of nutritional requirements and feeding strategies for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus［J].Bioresource Technology，2006，98（10）：2010－2017.

［12]康紹蘭，劉國勝，董金皋，等.幾種植物病原真菌致病毒素的初步研究（I）［J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，18（4）：105－111.

［13]王智文，劉訓(xùn)理，何亮，等.Cp－S316菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其對煙草赤星病菌的抑制作用［J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（2）：723－728.