靶向上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞ZEB1-shRNA重組體構(gòu)建及功能研究①

陳登宇 陳峻崧 王 凈 曹文虎 張洪義 楊翠萍 張?jiān)葡?竇 駿

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，南京 210009)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)約占卵巢癌的90%，是女性生殖器常見腫瘤，因腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移使患者五年生存期低［1］。鋅指增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)參與卵巢癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移和癌干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)表型的維持，成為靶向治療 EOC 及 CSCs 的靶點(diǎn)［2，3］。本研究以 pSUPEREGFP1質(zhì)粒為載體，構(gòu)建靶向ZEB1的shRNA重組干擾質(zhì)粒shZEB1，轉(zhuǎn)染至人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，檢測其抑制ZEB1表達(dá)的效率，進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)判定ZEB1下調(diào)后對上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)性狀如克隆形成能力、遷移力、裸鼠體內(nèi)致瘤能力的影響，探討ZEB1作為分子靶點(diǎn)用于卵巢癌靶向治療的價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，購自上海細(xì)胞所;ZEB1單克隆抗體，Santa cruz公司;BALB/c雌性裸鼠，揚(yáng)州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心;RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司;質(zhì)粒小提及割膠純化試劑盒，Axygen公司;限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅡ及EcoRⅠ，大連寶生物公司;T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA連接酶，大連寶生物公司;脂質(zhì)體2000，Invitrogen公司;G418，Sigma公司;Trizol試劑，Invitrogen公司。

1．2 RT-PCR檢測 SKOV3細(xì)胞中 ZEB1、miR-200c表達(dá)情況 引物設(shè)計(jì)參照GeneBank中人ZEB1、U6及β-actin序列，應(yīng)用 Primer Premier5．0軟件，于基因不同外顯子上設(shè)計(jì)引物;miR-200c根據(jù)成熟體設(shè)計(jì)RT特異引物和PCR引物。SKOV3細(xì)胞抽提總RNA，RT-PCR擴(kuò)增ZEB1，并半定量PCR擴(kuò)增miR-200c，以U6作為內(nèi)參，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析判定miR-200c表達(dá)量，見表1。

1．3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定及轉(zhuǎn)染 設(shè)計(jì)與合成靶向ZEB1基因的 siRNA，針對人 ZEB1編碼基因ZEB1的cDNA序列(GenBank NM001128128)，根據(jù)pSUPER-EGFP1載體要求設(shè)計(jì)合成shRNA寡核苷酸模板，利用Dharmacon和Invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件尋找候選ZEB1的RNAi靶點(diǎn)序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。單鏈兩端包含保護(hù)堿基和BglⅡ和HindⅢ 酶切殘基。scramble-siRNA序列質(zhì)粒為不靶向任何基因的陰性對照序列。ZEB1-siRNA序列正義鏈:5'-GATCCCCAGGAAGAGGAGGAGGATAATTCAAGAGATTATCCTCCTCCTCTTCCTTTTTTGGAAA-3';反義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAA AAGGAAGAGGAGGAGGATAATCTCTTGAATTATCC TCCTCCTCTTCCTGGG-3'。scramble-siRNA序列正義鏈:5'-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA AGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAA-3';反義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGG G-3'。siRNA寡核苷酸鏈退火，雙酶切質(zhì)粒pSUPEREGFP1，將磷酸化 ZEB1-siRNA和回收質(zhì)粒片段pSUPER-EGFP1質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，4℃過夜，轉(zhuǎn)化新鮮感受態(tài)細(xì)菌，挑取克隆提取質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA(簡稱 shZEB1)，雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后有限稀釋法及G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;同法構(gòu)建和轉(zhuǎn)染pSUPEREGFP1-scramble-shRNA(簡稱 sramble)質(zhì)粒［4］。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小一覽表Tab．1 Primer sequence and product size

1．4 Western blot檢測ZEB1蛋白表達(dá) 取野生型SKOV3及轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒SKOV3細(xì)胞各5×105，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清獲細(xì)胞裂解蛋白，Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，再按常規(guī)方法行 Western blot檢測。

1．5 平板克隆形成試驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，按每板500個細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%［5］。

1．6 劃痕試驗(yàn) 將待觀測細(xì)胞種于6孔板中，待生長融合成片后進(jìn)行檢測。用無菌槍頭在孔中劃線，使劃線處無細(xì)胞生長;0、24、72小時(shí)，分別在顯微鏡相同位置下觀察劃線無細(xì)胞處的寬度，拍照記錄。分析計(jì)算:愈合度=(1－某時(shí)點(diǎn)劃痕寬度/原始劃痕寬度)×100%，判定細(xì)胞遷移能力。

1．7 裸鼠致瘤試驗(yàn) 分別取5×106/100μl sh-ZEB1-SKOV3和scramble-SKOV3細(xì)胞懸液，背部皮下注射4～6周齡BALB/c雌性裸鼠，每組4只，監(jiān)測各組小鼠腫瘤生長情況。致瘤腫塊分離后，由蘇木素伊紅HE染色光鏡下觀察其病理形態(tài)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 t檢驗(yàn)，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SKOV3細(xì)胞中ZEB1-mRNA表達(dá) SKOV3細(xì)胞經(jīng)總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄至cDNA并擴(kuò)增ZEB1后，所得產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AL2000 DNA maker作為分子量標(biāo)志，電泳結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞中存在ZEB1基因的表達(dá)(圖1A)。

2．2 重組質(zhì)粒酶切鑒定 pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA、pSUPER-EGFP1-scramble-shRNA 與 pSU-PER-EGFP1空質(zhì)粒，分別經(jīng)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示(圖1B)，pSUPER-EGFP1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，其片段約在237 bp處，構(gòu)建質(zhì)粒酶切產(chǎn)物片段約在291 bp處，均符合設(shè)計(jì)片段大小，表明shZEB1和scramble質(zhì)粒構(gòu)建成功，且進(jìn)一步測序證實(shí)。

圖1 shZEB1質(zhì)粒構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)SKOV3細(xì)胞株篩選Fig．1 shZEB1 p lasm id construction and screening stable transfection SKOV3 cells

2．3 陽性克隆篩選 以含800μg/ml G418初步篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，隨后在熒光顯微鏡下找出表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，以有限稀釋法篩選得到陽性單個細(xì)胞克隆(圖1C)，隨后擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

2．4 SKOV3細(xì)胞中ZEB1蛋白表達(dá) 用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取總蛋白經(jīng) Western blot檢測ZEB1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖1D)，與野生型 SKOV3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP1-scramble質(zhì)粒SKOV3細(xì)胞ZEB1蛋白表達(dá)與野生型基本相同，而轉(zhuǎn)染sh-ZEB1質(zhì)粒組細(xì)胞ZEB1蛋白表達(dá)顯著下降。

2．5 平板克隆檢測 培養(yǎng)10天，培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆，終止培養(yǎng)后用吉姆薩染色，計(jì)數(shù)克隆形成率，shZEB1組較scramble組SKOV3細(xì)胞中克隆形成率降低，P ＜0．05(圖2)。

2．6 細(xì)胞遷移力檢測 0、24、72小時(shí)分別在顯微鏡相同位置下觀察劃線無細(xì)胞處豎線寬度，拍照記錄后再行各無細(xì)胞區(qū)域?qū)挾缺容^，判斷愈合度。由圖3A～D可見，shZEB1組較scramble組及野生型組SKOV3細(xì)胞中愈合度降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異有顯著性，P＜0．05。該結(jié)果顯示，ZEB1低表達(dá)時(shí) SKOV3細(xì)胞遷移力降低。

圖2 平板克隆形成率Fig．2 Plate colony formation ratios

圖3 劃痕試驗(yàn)Fig．3 W ound healing assay

圖4 半定量RT-PCR檢測m iR-200c表達(dá)Fig．4 m iR-200c detected by sem i-quantitative RT-PCR

圖5 體內(nèi)不同SKOV3細(xì)胞裸鼠致瘤能力比較Fig．5 Comparison of the tumorigenicity of the different SKOV3 cells in the nudemice

圖6 不同轉(zhuǎn)染SKOV3對裸鼠致瘤腫塊病理切片(HE染色，×400)Fig．6 Pathological section of different transfection SKOV3 tumor in nudemice(HE staining，×400)

2．7 miR-200c檢測 RT-PCR檢測miR-200c的表達(dá)(圖4)，半定量RT-PCR分析shZEB1組較scramble組SKOV3細(xì)胞中miR-200c表達(dá)量增加，而miR-200c表達(dá)量增加會引起 SKOV3細(xì)胞遷移力降低［6］。

2．8 體內(nèi)細(xì)胞致瘤能力比較 5周后觀察不同轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞裸鼠致瘤情況，致瘤率比較結(jié)果顯示shZEB1組較scramble組致瘤性下降(圖5)。大體觀察shZEB1 SKOV3腫塊體積較小，生長緩慢;而scramble SKOV3腫塊生長較快體積大，邊緣粘連包膜不清，病理切片(圖6)HE染色見腫塊中明顯核異質(zhì)癌細(xì)胞，增生活躍，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色，細(xì)胞核漿比例增大，細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形，見有核仁。

3 討論

EOC約占卵巢癌的90%，是女性常見腫瘤，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，但因腫瘤易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，導(dǎo)致病死率占各類婦科腫瘤的首位［1］。因此，探明卵巢癌發(fā)生的起因，針對病因進(jìn)行有針對性治療，尤其抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移清除CSCs才能從根本上治愈卵巢癌。ZEB1蛋白參與卵巢癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移和CSCs表型的維持，成為靶向治療EOC及CSCs有價(jià)值的靶點(diǎn)，對于根治 EOC 及 CSCs具有重要意義［2，3］。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)可與特異性mRNA結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解，進(jìn)而導(dǎo)致目的基因表達(dá)下調(diào)。利用載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA，是目前RNAi技術(shù)運(yùn)用的主要手段，載體大多選用自身攜帶的RNA依賴性聚合酶Ⅲ的啟動子，如U6或H1等啟動shRNA編碼序列，穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)shRNA，經(jīng)Dicer酶切產(chǎn)生siRNA，特異性地降解靶mRNA，使RNAi發(fā)揮作用時(shí)間更長、更穩(wěn)定，從而達(dá)到有效抑制靶基因表達(dá)的目的［7］。本實(shí)驗(yàn)所選用的pSUPER-EGFP1質(zhì)粒以新霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記，且在巨細(xì)胞病毒啟動子CMV的驅(qū)動下可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP，受紫外光源激發(fā)即可發(fā)出綠色熒光，可檢測轉(zhuǎn)染效率，以利選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞克隆。為準(zhǔn)確有效抑制靶基因表達(dá)，我們首先針對靶基因ZEB1編碼基因mRNA鏈，參考相應(yīng)文獻(xiàn)及siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則、評分標(biāo)準(zhǔn)，選取有效靶向ZEB1 mRNA的siRNA鏈，經(jīng)BLAST比對證實(shí)其能特異性靶向ZEB1 mRNA。隨后根據(jù)所用載體特點(diǎn)，在siRNA兩端加上相應(yīng)地酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基、莖環(huán)序列等，合成靶向ZEB1 mRNA的shRNA序列，并成功將其連接到載體質(zhì)粒上。同時(shí)合成了不靶向任何mRNA的無關(guān)序列構(gòu)建重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株作為陰性對照。根據(jù)質(zhì)粒的新霉素抗性和表達(dá)EGFP特點(diǎn)，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng) Western blot證實(shí)所構(gòu)建的shZEB1干擾質(zhì)?？捎行б种芞EB1在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)，這為下一步研究抑制ZEB1表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞生物學(xué)特征的改變奠定了基礎(chǔ)。

ZEB1是上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin)轉(zhuǎn)錄抑制因子，具有典型的鋅指結(jié)構(gòu)，可以和靶基因E-cadherin啟動區(qū)的E-box結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附性降低、移動性增強(qiáng)。EOC中miR-200c與ZEB1構(gòu)成雙向負(fù)反饋環(huán)調(diào)節(jié)腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)進(jìn)展。其中，ZEB1可抑制miR-200c的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;而miR-200c表達(dá)增高又可反過來抑制靶基因ZEB1等的蛋白表達(dá)、降低癌細(xì)胞移動和生長能力。EOC臨床分級越高，ZEB1蛋白表達(dá)越高，miR-200c越少，E-cadherin蛋白降低越顯著，腫瘤多轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、預(yù)后越差［6，8］。EOC 中 ZEB1 和ZEB2、snail及Slug均可以結(jié)合在E-cadherin啟動子區(qū)的E-box上，抑制 E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄［9］。通過ZEB1基因沉默，可降低EOC及CSCs EMT和生長能力，從而降低轉(zhuǎn)移性和致瘤性及耐藥性、減少CSCs的抵抗性［10］。為進(jìn)一步研究針對 EOC及CSCs EMT過程中的關(guān)鍵分子ZEB1進(jìn)行靶向治療的價(jià)值，我們構(gòu)建了人ZEB1干擾質(zhì)粒，用于ZEB1基因沉默后功能性實(shí)驗(yàn)研究。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，shZEB1 SKOV3細(xì)胞內(nèi)ZEB1表達(dá)被抑制，導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞克隆形成能力、遷移力及致瘤性下降，miR-200c表達(dá)增高。這些結(jié)果顯示，ZEB1可作為分子靶點(diǎn)用于腫瘤細(xì)胞靶向治療，為EOC及CSCs的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

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