彭大為 李建旺 元建華 劉英平 于偉玲 孟 娟 羅 潔

(?？谑腥嗣襻t(yī)院(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院)腫瘤科，?？?70208)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在肺癌患者中占80%～85%，30%患者可行手術(shù)治療［1］。約70% ～80%的患者發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期。美國報道，肺癌確診時，50%已超過65歲，30%超過70歲。意大利報道65歲以上的肺癌病人占60%以上。我國肺癌發(fā)病年齡自40歲開始上升，發(fā)病及死亡高峰均在75歲左右。70歲以上的老年患者構(gòu)成一組特殊的龐大的NSCLC人群，其治療對策成為臨床研究的重要內(nèi)容。體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過繼免疫療法是繼手術(shù)、化療、放療之外的另一種重要的腫瘤治療方法。樹突細(xì)胞(DC)識別病原，激活獲得性免疫系統(tǒng)，殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，二者聯(lián)合確保了一個高效和諧的免疫反應(yīng)的完成。2008年9月26日美國食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)培美曲塞(Pemetrexed disodium，PEM)聯(lián)合順鉑作為NSCLC的一線藥物，適用于ⅢB/Ⅳ期非鱗癌。我們通過采用DC/CIK聯(lián)合培美曲塞二鈉或培美曲塞二鈉單藥治療47例老年中晚期NSCLC，觀察其療效和不良反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院腫瘤科自2009年1月至2011年6月經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診，且均經(jīng)X線、CT等檢查有明確病灶的ⅢA～Ⅳ期初診肺腺癌患者47例，KPS評分70～90分。其中男性29例，女性18例;年齡65～79歲，中位年齡71歲，75歲以上4例;臨床分期:ⅢA期8例，ⅢB期24例，Ⅳ期15例。47例患者隨機分為聯(lián)合治療組:DC/CIK聯(lián)合培美曲塞二鈉(n=24)和單純化療組:培美曲塞二鈉(n=23)單藥治療。所有病例在接受藥物治療前，均未接受化療及放療，兩組年齡、病理類型、臨床分期等無顯著性差異。

1.2 治療方法

1.2.1 DC、CIK細(xì)胞的培養(yǎng)和擴增 患者入院后行X線、CT檢查。根據(jù)X線、CT確定腫瘤大小，計算出腫瘤體積。采血前24小時應(yīng)用GM-CSF行外周血干細(xì)胞動員，經(jīng)CS-3000血細(xì)胞分離機分別采集患者的外周血5L中的新鮮抗凝外周血單核細(xì)胞(PBMNC)，再用聚蔗糖400(中國科學(xué)院生物物理研究所)分離后經(jīng)Hank's液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個核細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106L-1。第一天加rh-干擾素γ1 000 U/ml，第2天開始加入抗CD3單抗 50μg/ml，IL-1a 100 U/ml，IL-2 1 000 U/ml，連續(xù)培養(yǎng)3天，更換含有上述因子的培養(yǎng)液1次，連續(xù)培養(yǎng)10～20天，每周2次測定白細(xì)胞增殖率和 CD3、CD56陽性細(xì)胞率，然后以DC∶CIK=1∶3比例和CIK細(xì)胞混合，用CIK培養(yǎng)液培養(yǎng)產(chǎn)生DC-CIK細(xì)胞。用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)，動態(tài)觀察DC共培養(yǎng)物的表型變化，分別于細(xì)胞培養(yǎng)的第9天檢測DC表面標(biāo)記CD40、CD80、HLA-DR和第9、14天檢測CIK和DC-CIK共培養(yǎng)物表面標(biāo)記CD3、CD56、CD4、CD8。當(dāng)細(xì)胞數(shù)擴增陽性目標(biāo)值達(dá)到85%及以上時進(jìn)行細(xì)胞治療。

1.2.2 培美曲塞二鈉組治療方法 培美曲塞二鈉(江蘇豪森有限公司生產(chǎn)，商品名普來樂)500 mg/m2，靜脈滴入超過10分鐘，1天，21天為1個周期;培美曲塞二鈉使用前1周開始每日口服葉酸400μg，直到培美曲塞二鈉治療結(jié)束后3周;培美曲塞二鈉使用前1周開始，每3個化療周期肌肉注射一次維生素B12 1 000μg;培美曲塞使用前24小時口服地塞米松4 mg，2次/天，連服3天。

1.2.3 DC/CIK聯(lián)合培美曲塞二鈉治療方法 患者行PBMNC采集后，行培美曲塞二鈉治療。采集后經(jīng)實驗室培養(yǎng)2周左右，進(jìn)行回輸DC細(xì)胞及CIK細(xì)胞，2～3次/周，一次回輸 DC細(xì)胞1×109～1×1010，CIK 1×1010～2×1012。每隔1個月重復(fù)治療1周期。

兩組化療前均常規(guī)給予5-HT3受體拮抗劑等預(yù)防嘔吐，化療期間監(jiān)測血常規(guī)，出現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制時給予粒細(xì)胞集落刺激因子，化療過程配合支持治療。入選患者至少接受2個周期以上化療，最多接受6個周期化療。

1.3 療效評價 療效評價采用螺旋CT增強掃描，每2個周期進(jìn)行評價，依據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)進(jìn)行療效評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)，臨床獲益率CR+PR+SD。不良反應(yīng)依據(jù)美國國立癌癥研究所常見毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTC310)進(jìn)行評價。生存質(zhì)量評價根據(jù)患者Karnofsky評分和體質(zhì)量;中位生存時間(MST)定義為半數(shù)患者經(jīng)歷死亡或末次隨診時間。生存期為治療開始至死亡或末次隨診的時間。隨訪截止時間是2011年12月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間療效、1年生存率及不良反應(yīng)發(fā)生率比較用χ2檢驗;兩組間中位生存時間比較用 Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK和DC-CIK培養(yǎng)結(jié)果 CIK和DC-CIK共培養(yǎng)的增殖活性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞均明顯增殖，而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞具有更高的增殖活性。細(xì)胞在第3天后開始增殖，第5～6天快速增長，培養(yǎng)20天時，CIK細(xì)胞和 DC-CIK共培養(yǎng)的細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為120和1 000。CIK對Bel-7404細(xì)胞的細(xì)胞毒活性為46.8%。

2.2 免疫治療前后患者外周血免疫學(xué)指標(biāo)變化聯(lián)合治療組患者治療后外周血CD3+CD8+雙陽性細(xì)胞的比例升高(P＜0.05)，CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的比例大幅升高(P＜0.01);單純組患者治療后外周血CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的比例無明顯變化(P＞0.05)。兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，表1)。

2.3 療效觀察 患者經(jīng)1個療程 DC-CIK靜脈回輸治療后自覺癥狀改善，食欲增強，睡眠改善，疼痛減輕，體質(zhì)量無明顯下降，體力較前好轉(zhuǎn)，培美曲塞治療的毒副反應(yīng)減輕。聯(lián)合治療組和單純化療組臨床獲益率分別是 66.67%和 56.52%(P ＜0.05，見表 2)，中位生存期分別是 9.3 個月和8.7 個月(P ＞0.05)，1 年生存率分別是27.6%和 25.4%(P ＞0.05)。

2.4 兩組患者治療的不良反應(yīng) 依據(jù)美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，化療期間兩組患者均出現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制及消化道反應(yīng)。在聯(lián)合治療組患者接受免疫治療過程中，并未出現(xiàn)Ⅲ度以上嚴(yán)重不良反應(yīng)?；剌敽蟪Ｒ姷牟涣挤磻?yīng)(7例)為發(fā)熱，多數(shù)可自行消退，1例采用解熱鎮(zhèn)痛藥。1例出現(xiàn)過性寒戰(zhàn)，肌注異丙嗪后緩解。兩組主要的不良反應(yīng)是骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)以及乏力，其中聯(lián)合治療組中性粒細(xì)胞降低發(fā)生率明顯低于單純化療組(Ⅰ ～Ⅱ度:9.05%vs 19.09%，P＜0.05)，Ⅲ ～ Ⅳ度:2.52%vs 9.27%，P ＜0.05);聯(lián)合治療組胃腸道反應(yīng)發(fā)生率也明顯低于單純化療組(Ⅰ ～ Ⅱ度:6.29%vs 15.09%，P ＜0.05;Ⅲ ～ Ⅳ度:2.76%vs 8.91%，P ＜0.05)。

2.5 治療前后患者的臨床受益反應(yīng)變化 聯(lián)合治療組患者治療前KPS評分80分者5例，70分者12例，60分者7例;治療后顯效9例，有效9例，總有效率75%。單純化療組患者治療前KPS評分80分者6例，70分者10例，60分者7例;治療后顯效4例，有效7例，總有效率52.2%。聯(lián)合治療組治療有效率高于單純化療組(P＜0.05)。聯(lián)合治療組治療前 KPS 評分70.2 ±5.8，治療后 79.1 ±9.3，較治療前升高(P＜0.05)，單純化療組治療前KPS評分71.5 ±7.5，治療后72.8 ±10.5，較治療前無明顯變化(P＞0.05)。兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，表3)。

表1 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物變化的比較Tab.1 Comparison of the serum tumor markers before and after the therapy in 2 groups

表2 聯(lián)合治療組和單純化療組療效對比Tab.2 Comparison of therapeutic effect between combination therapy group and chemotherapy group

表3 兩組患者治療前后的臨床受益反應(yīng)比較Tab.3 Comparison of the clinical benefit response before and after the therapy in 2 groups

3 討論

晚期非小細(xì)胞肺癌常用含鉑類的聯(lián)合化療，有效率在30% ～50%［2］。并且，年齡的增加意味著患者骨髓儲備功能降低，藥物的清除能力降低，老年患者的整體化療耐受性差，因此選擇安全高效的化療方案一直是腫瘤科醫(yī)師的研究方向。目前，鉑類藥物聯(lián)合第三代化療藥物已成為晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案，但是在總有效率、1年生存時間等方面仍然不盡如人意，而且其不良反應(yīng)如血小板減少、貧血較多，影響了患者的依從性［3］。培美曲塞(Pemetrexed)是一種多靶點葉酸拮抗劑，其作用機制主要是通過抑制胸苷酸合成酶(Thymidylate synthetase，TS)二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)和甘氨酸核糖核苷甲?；D(zhuǎn)移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase，GARFT)從而阻斷嘌呤和嘧啶合成使細(xì)胞分裂停止于S期抑制腫瘤細(xì)胞的生長［4］，2004年美國 FDA批準(zhǔn)培美曲塞用于晚期NSCLC的二線治療。2008年9月26日美國食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)培美曲塞聯(lián)合順鉑作為NSCLC的一線藥物，適用于ⅢB/Ⅳ期非鱗癌。

Bearz等［5］于2008年報道了一項Ⅲ期臨床研究，培美曲塞二鈉二線治療160例老年肺癌患者，有效率40%，中位生存期12個月，較先前報道更有效，同時中性粒細(xì)胞下降、發(fā)熱等不良反應(yīng)也顯著降低。2009年的ASCO會議上，禮來公司公布了力比泰(注射用培美曲塞二鈉)在663例受試者應(yīng)用的臨床試驗結(jié)果，該試驗證實力比泰作為維持療法藥物時，可以延長患者的總體生存期，在非鱗癌受試者當(dāng)中，力比泰受試組平均生存期可長達(dá)15.5個月，而安慰劑對照組僅為10.3個月。試驗證實，老年肺癌患者如果PS評分較好，化療較維持治療能顯著延長生存期和改善生活質(zhì)量［6］。Grnberg［7］報道培美曲塞治療效果好，且毒副反應(yīng)輕而被與鉑類藥物聯(lián)合應(yīng)用于晚期NSCLC的一線治療。另外，培美曲塞對于晚期NSCLC的療效與NSCLC的病理類型相關(guān)，培美曲塞可顯著性提高腺癌及大細(xì)胞肺癌的生存率，可能與腺癌患者胸苷酸合成酶(TS)的表達(dá)水平顯著低于鱗癌患者，使得葉酸代謝被培美曲塞更好地抑制有關(guān)［8］。

DC是目前為止發(fā)現(xiàn)的人體最有效的抗原提呈細(xì)胞(APC)之一。APC與T細(xì)胞之間的相互作用所誘發(fā)的免疫應(yīng)答是免疫抑瘤效應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。DC在大多數(shù)組織體內(nèi)以未成熟狀態(tài)存在，不能直接刺激T細(xì)胞，但具有特殊的捕獲和加工抗原的能力。腫瘤細(xì)胞表面缺乏MHC和共刺激分子，無法激活T細(xì)胞免疫，是腫瘤免疫逃逸的重要機制［9］。DC與CIK共培養(yǎng)后產(chǎn)生的細(xì)胞群體比同原CIK細(xì)胞具有更強的增殖活性。CIK與DC相結(jié)合，不僅提高了CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，也能顯著提高DC的功能［10］，DC與CIK混合培養(yǎng)時，兩者能相互調(diào)節(jié)而增加細(xì)胞因子釋放和增強細(xì)胞毒性，顯著提高CIK細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性，臨床治療效果優(yōu)于CIK等其他效應(yīng)細(xì)胞。體內(nèi)外實驗研究均表明DC能誘導(dǎo)腫瘤宿主對特異性抗原的免疫應(yīng)答，提高腫瘤宿主免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗病毒活性［11］。CIK同時表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，具有T淋巴細(xì)胞強大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。CIK細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子(如IL-4、IFN-α 等)，且具有比 LAK、CD3AK 細(xì)胞更強的殺傷活性［12］。國內(nèi)外的臨床研究表明，一般在放療、化療后間隔2～4周，在機體免疫力有所恢復(fù)時，輸入CIK細(xì)胞，可提高腫瘤患者的緩解率，并在清除微小殘留病灶方面發(fā)揮重要作用［13］。

本研究中，47例患者均完成2個周期以上化療且可評價療效，兩組患者療效均較好，但聯(lián)合治療組具有更好的臨床獲益及更少的不良反應(yīng)，并且具有更高的生存質(zhì)量。研究結(jié)果表明，自體CIK細(xì)胞及DC細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞治療老年中晚期NSCLC療效較好，不良反應(yīng)輕，可作為老年中晚期NSCLC一線治療的選擇之一。但由于本研究病例數(shù)較少，尚需擴大病例進(jìn)一步證實。

1 Jemal A，Bray F，Center M M et al.Global cancerstatistics［J］.CA Cancer J Clin，2011;61(2):69-90.

2 湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2003:696-729.

3 Stinchcombe T E，Socinski M A.Current treatments for advanced stage non-small cell lung cancer［J］.Proc Am Thorac Soc，2009;6(2):233-241.

4 Adjei，Alex A .Pemetrexed(Alimta):a novel multitargeted antifolate agent［J］.Expert Review of Anticancer Therapy，2003;6(12):145-156.

5 Bearz A，Garassino I，Cavina R et al.Pemetrexed single agent in previously treated non-small cell lung cancer:a multi-institutional observational study［J］.Lung Cancer，2008;60(2):240-245.

6 Lilenbaum R C.Treatment of patients with advanced lung cancer and poor performance status［J］.Clin Lung Cancer，2004;6(Suppl 2):S71-S74.

7 Grnberg B H，Bremnes R M，F(xiàn)ltten O et al.PhaseⅢ study by theNorwegian lung cancer study group:pemetrexed plus carboplatin compared with gemcitabine plus carboplatin as first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2009;27(19):3217-3224.

8 Scagliotti G V，Parikh P，Yon Pawel J et al.PhaseⅢ study comparing cisplatin plus gemcitatine with cisplatinplus pemetrexed in chemotherapy naive patients with advanced stage non small cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2008;26(21):3543-3551.

9 Wang Q J，Wang H，Pan K et al.Comparative study on anti-tumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells，dendritic cells-CIK(DC-CIK)，and semi-allogeneic DC-CIK ［J］.Chin J Cancer，2010;29(7):641-648.

10 Schott M，Seisslar J.Dendritic cell vaccination:new hope for the treatment of metastasized endocrime malignancies［J］.Trends Endocrinal Metab，2003;14(4):156-162.

11 Friedl J，Stift A，Paolini P et al.Tumor antigen pulsed dendritic cells enhance the cytolytc activity of tumor infiltrating lymphocytes inhum an heptocelluluar cancer［J］.Cancer Biother Radiopharm，2000;15(5):477-486.

12 Linn Y C，Lau SK，Liu B H et al.Characterization of the recognition and functional heterogeneity exhibited by cytokine-induced killer cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell［J］ .Immunology，2009;126(3):423-435.

13 陳復(fù)興，劉軍權(quán)，張南征et al.自身細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞過繼性免疫治療惡性腫瘤的臨床觀察［J］.癌癥，2002;17(4):187-188.