黃國(guó)清 劉秋爽 程永紅 黎 陽 郭 敏 郭強(qiáng)忠 金 鑫 李文郎

(深圳市寶安區(qū)觀瀾人民醫(yī)院，深圳518110)

獲得性再生障礙性貧血 (Acquired Aplastic Anema，AA.簡(jiǎn)稱:再障)是一種較為少見的血液系統(tǒng)疾病，約有一半的患者為三十歲以下的青年，在西方發(fā)病率約為每百萬分之二，在亞洲的發(fā)病率約為西方的2～3倍［1-3］。再生障礙性貧血是由多種原因引起的造血干細(xì)胞數(shù)量下降和功能的異常，導(dǎo)致骨髓衰竭而引起的全血細(xì)胞減少的一種異質(zhì)性疾病。其發(fā)病機(jī)制通常認(rèn)為與造血干細(xì)胞的損傷、骨髓微環(huán)境的異常以及免疫功能紊亂。而免疫異常是近10年來有關(guān)再障病因和發(fā)病機(jī)制研究中最活躍的領(lǐng)域，本研究的目的在于通過研究再障患者外周血輔助性 T細(xì)胞(Th，相當(dāng)于 CD4+T)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc，相當(dāng)于 CD8+T)，CD4+/CD8+，NK 細(xì)胞，NKT細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子含量變化，進(jìn)一步探討再障的發(fā)病機(jī)制，為再障以及自身免疫疾病的細(xì)胞靶向治療和免疫治療提供理論基礎(chǔ)及新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年3月至2012年2月經(jīng)深圳市觀瀾人民醫(yī)院、湛江中心人民醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院診治的初發(fā)重型再障患者20例，其中男性11例，女性9例，年齡16～31歲，平均年齡21.3歲，病例診斷符合2007年修訂的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［6］;收集再障經(jīng)免疫治療及輸血治療后骨髓象、血象及網(wǎng)織紅細(xì)胞比例提示造血恢復(fù)的患者21例，男性9例，女性12例，年齡20～35歲，平均年齡22.3歲;同時(shí)收集20例正常志愿者外周血標(biāo)本，男性9例，女性 11例，年齡 20～27歲，平均年齡20.6 歲。

1.2 主要試劑 流式細(xì)胞檢測(cè)用抗體和紅細(xì)胞裂解液均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海華精生物高科技有限公司;分選細(xì)胞用磁珠購(gòu)自德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞檢測(cè)T細(xì)胞亞群 取待檢靜脈全血100μl，加入上樣管中，采用雙色和三色標(biāo)記法根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同分別加入以下抗體組合:CD3 PerCP-Cy5.5、CD4 FITC;CD3PerCP-Cy5.5、CD8 PE;CD3 FITC、CD16+56 PE;CD4 FITC、CD25 APC、CD127 PE;CD3 FITC、CD19 PE，震蕩混勻，常溫孵育20分鐘，加紅細(xì)胞裂解液850μl裂解10分鐘，1 500 r/min離心7分鐘，PBS沖洗一次，加 200μl PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，采用FACS Diva軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.2 免疫磁珠法分選Treg細(xì)胞 取再生障礙性貧血患者，正常志愿者的靜脈全血4～8 ml，利用細(xì)胞分離液Focil分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMNC)，按照使用說明書進(jìn)行免疫磁珠分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞因子 將分選好的細(xì)胞以1×106cell L-1接種于24孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并加PHA(5 mg/ml)刺激培養(yǎng)，置于5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24小時(shí)、48小時(shí)后收集各組上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行IL-10、IL-35、TGF-β的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析各組 CD4+、CD8+、NK、NKT、Treg 的數(shù)值，所有正態(tài)分布數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較單因素方差分析(One-way ANOVA)比較，以P＜0.05為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 初發(fā)再障組、治療后造血恢復(fù)組及正常組T細(xì)胞亞群檢測(cè) 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)初發(fā)再障組，治療后造血功能恢復(fù)組，正常組中CD4+、CD8+、NK、NKT、Treg細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，其中 CD4+、Treg的表達(dá)在初發(fā)再障組比恢復(fù)組及正常組均低(P＜0.05)，而CD8+細(xì)胞的比例比其他二組均明顯增高(P＜0.05)，NK、NKT細(xì)胞比例無明顯變化，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)詳見表1，各組流式圖見圖1。

表1 各組CD4+、CD8+、NK、NKT、Treg細(xì)胞比例(%±s)Tab.1 The ratio expression of CD4+，CD8+，NK，NKT，Treg cells(%±s)

表1 各組CD4+、CD8+、NK、NKT、Treg細(xì)胞比例(%±s)Tab.1 The ratio expression of CD4+，CD8+，NK，NKT，Treg cells(%±s)

Note:1)P ＜0.05 vs control.

NK NKT Treg Aplastic anemia group 26.01 ±3.01) 49.35 ±5.31) 15.56 ±3.65 4.37 ±0.09 3.16 ±1.021)Groups CD4+ CD8+9.96 ±5.12 5.12 ±0.12 6.08 ±1.47 Hematopoietic recovery group 35.46 ±2.96 32.03 ±4.32 18.12 ±2.78 4.82 ±1.83 5.86 ±1.51 Normal control group 39.63 ±7.62 28.54 ±7.54 1

圖1 再障組患者T細(xì)胞亞群細(xì)胞流式圖Fig.1 The proportion of CD4+，CD8+，NK，NKT，Treg cells by FACS

表2 各組IL-10、IL-35、TGF-β的表達(dá)水平(ng/L±s)Tab.2 The ratio expression of IL-10，IL-35，TGF-β(ng/L±s)

表2 各組IL-10、IL-35、TGF-β的表達(dá)水平(ng/L±s)Tab.2 The ratio expression of IL-10，IL-35，TGF-β(ng/L±s)

Note:1)P ＜0.05 vs control.

24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h Aplastic anemia group 160 ±7.851) 172 ±9.131) 34 ±3.231) 36 ±5.891) 55 ±4.761) 60 ±6.741)Group IL-10 IL-35 TGF-β 04 75 ±4.58 75 ±3.21 80 ±5.56 Hematopoietic recovery group 206 ±6.57 213 ±5.87 65 ±4.45 69 ±7.12 70 ±5.32 76 ±5.34 Normal control group 215 ±5.52 226 ±4.68 73 ±6.

2.2 Treg細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平分離培養(yǎng)Treg細(xì)胞24、48小時(shí)后，收獲初發(fā)再障組、再障造血恢復(fù)組和正常組的細(xì)胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè) IL-10、IL-35、TGF-β 的表達(dá)，結(jié)果顯示:初發(fā)再障組的上清液中，IL-10、IL-35、TGF-β的表達(dá)量比恢復(fù)組及正常組表達(dá)量顯著低下(P＜0.05)?；謴?fù)組與正常組比較無明顯差異(P ＞0.05)，見表2。

3 討論

再障的顯著特點(diǎn)是骨髓造血細(xì)胞衰竭引起的全血細(xì)胞減少，患者常常表現(xiàn)出明顯的貧血癥狀，在常規(guī)藥物治療無法達(dá)到預(yù)期結(jié)果的情況下，往往需要依靠輸注紅細(xì)胞或者成份血來維持，但其往往也帶來很多副作用［1］。過去多年對(duì)再障的研究主要是集中兩個(gè)方面:一是“種子”學(xué)說，即造血干細(xì)胞的研究，主要集中在造血干細(xì)胞的水平;另一方面則是所謂的“土壤”學(xué)說，即造血微環(huán)境的變化，但究竟誰是主要的病因，兩者是否存在相關(guān)性目前并沒有一個(gè)十分確定的結(jié)論，這同時(shí)也證實(shí)了再障發(fā)病機(jī)制是一個(gè)難點(diǎn)［2］。作為一種自身免疫性疾病，其T細(xì)胞免疫功能的異常成為近年來研究的熱點(diǎn)。

目前的研究已經(jīng)證實(shí)，再障與其它自身免疫性疾病一樣存在CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Treg細(xì)胞的缺陷及功能異常［3］。我們的第一部分研究結(jié)果表明，在再障患者的體內(nèi)，CD4+T淋巴細(xì)胞、Treg細(xì)胞的表達(dá)水平明顯低于恢復(fù)組和正常對(duì)照組，而這正好與CD4+T淋巴細(xì)胞的功能相符合，CD4+T淋巴細(xì)胞主要促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖與分化，在細(xì)胞分化過程中起到正向的調(diào)控作用;而研究結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞卻比正常組，和治療恢復(fù)組明顯增高，這從一個(gè)側(cè)面說明，CD8+T淋巴細(xì)胞可能在再障發(fā)病機(jī)制中扮演著負(fù)向的調(diào)控作用，因?yàn)橐延械难芯勘砻?，CD8+T淋巴細(xì)胞不斷對(duì)骨髓造血細(xì)胞具有直接抑制作用，還激活與異常免疫有關(guān)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，釋放γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子 α(TNF-α)等造血負(fù)調(diào)控因子［4］。

我們的第二部分研究結(jié)果表明，再障患者體內(nèi)的IL-10、IL-35、TGF-β 均比正常人低，說明再障患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子低，而它們又是Treg細(xì)胞主要分泌因子，它們可以直接作用于T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的應(yīng)答，從而調(diào)控相關(guān)免疫。此結(jié)果和第一部分的結(jié)果具有相關(guān)性，說明在再障患者體內(nèi)確實(shí)存在著免疫系統(tǒng)的功能紊亂。但是，它們具體是如何調(diào)控的目前還沒有一個(gè)明確的結(jié)論［5］。

當(dāng)前，再障的發(fā)病機(jī)制研究已漸集中到免疫學(xué)機(jī)制研究，研究表明，再生障礙性貧血與眾多自身免疫性疾病一樣有CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Treg細(xì)胞的異常［6］。而T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)再生障礙性貧血患者不僅存在T細(xì)胞數(shù)量異常，也存在功能和表型改變［7］，其外周血T細(xì)胞亞群失衡，輔助性 T細(xì)胞減少，抑制性 T細(xì)胞增多，CD4+/CD8+降低或倒置等［8］。因此，對(duì)再生障礙性貧血免疫學(xué)機(jī)制研究對(duì)于了解再障患者中的免疫細(xì)胞功能以及和其他免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，以及為未來開展靶向免疫治療均具有非常重要的意義。

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