張學(xué)乾，杜 蕊，楊慈清，2，陳樹林，趙慧英，趙善廷＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，河南 新鄉(xiāng) 453003）

在哺乳類動物中，成體神經(jīng)發(fā)生主要局限于海馬結(jié)構(gòu)中的齒狀回和側(cè)腦室壁的亞室?guī)1－3]，其中海馬作為腦中的一個重要結(jié)構(gòu)，不僅在學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知等過程中發(fā)揮著重要作用，而且還控制著動物的食欲及覓食行為[4]，海馬損傷會導(dǎo)致一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。海馬通過成體神經(jīng)發(fā)生源源不斷地產(chǎn)生新的神經(jīng)元[5－6]，這些新生神經(jīng)元會融入到原有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中[7－8]，參與這些功能的行使，因此海馬功能的正常運轉(zhuǎn)與成體神經(jīng)發(fā)生密不可分[9－10]。豬作為一種重要的家畜，如果能夠控制其食欲和飲食，可降低其飼養(yǎng)難度，而想要達(dá)到這一點，需要對豬的海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行充分了解，而且對其功能行使的深入研究有助于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治。但到目前為止，成體神經(jīng)發(fā)生的研究主要以小鼠、大鼠及鳥類為動物模型，而對大型家畜的研究卻很少，豬的成體神經(jīng)發(fā)生的研究尚未見報道。以前，對于成體神經(jīng)發(fā)生的研究主要靠一些標(biāo)記增殖細(xì)胞的技術(shù)來完成，其中以 BrdU（5－bromodeoxyuridine，5－溴脫氧尿嘧啶核苷）標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用最為廣泛[11－13]。近年來雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）作為一種新的未成熟神經(jīng)元的特異標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于成體神經(jīng)發(fā)生的研究，DCX是一種微管相關(guān)蛋白，與神經(jīng)元的遷移密切相關(guān)[14－15]，在成體神經(jīng)發(fā)生期間，它隨著神經(jīng)母細(xì)胞的增殖開始表達(dá)，在第二周達(dá)到頂峰，并隨著神經(jīng)元的成熟逐漸消失[16]。大量研究證明DCX可以作為一種可靠的標(biāo)記物來研究動物的成體神經(jīng)發(fā)生[17－18]。本課題對成年豬和小鼠海馬的結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)發(fā)生的特點進(jìn)行對比分析，在對豬海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行分區(qū)、分層和細(xì)胞構(gòu)筑方面研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)而對其成體神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行初步觀察和研究，為大型哺乳動物海馬結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究，以及齒狀回中成體神經(jīng)發(fā)生的研究提供形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)，并為畜牧獸醫(yī)的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 成年雄性昆白小鼠8只，體重38g左右，年齡3個月，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心；成年雄性豬3頭，種系為光明豬配套系，6月齡左右，購自陜西楊凌本香集團(tuán)。

1.1.2 試劑與主要儀器 BrdU（Sigma），大鼠抗BrdU IgG（Serotec，Düsseldorf，Germany），羊 抗DCX IgG（Santa Cruz，heidelberg，Germany），小鼠抗NeuN IgG（Chemicon，Hofheim，Germany），兔抗GFAP IgG（Boehringer，Mannheim，Germany），免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司），驢抗羊568、羊抗大鼠488（Chemicon，Hofheim、），羊抗兔488（Jackson，Immunoresearch，Dianova），DAPI（Sigma）；VT 1000S震蕩切片機（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 BrdU注射與動物取材 取試驗小鼠3只按50mg／kg進(jìn)行腹腔內(nèi)注射BrdU，每隔12h注射1次，連續(xù)注射3d，最后1次注射BrdU 24h后取材。豬不做BrdU注射處理，所得切片進(jìn)行DCX、NeuN和GFAP染色觀察。

3只經(jīng)BrdU注射處理和5只不做任何處理的小鼠，用40g／L多聚甲醛全身灌注的方法取全腦。3頭健康成年豬，經(jīng)放血處死后，斷頸取頭，通過頸動脈進(jìn)行頭部40g／L多聚甲醛固定然后立即開顱取腦，切取腦兩側(cè)海馬。取兩種動物海馬中部部分，垂直于海馬縱軸進(jìn)行震蕩切片，切片厚度50μm。所得小鼠BrdU標(biāo)記的海馬切片用于BrdU／DCX熒光雙標(biāo)記，對于沒有經(jīng)過處理的小鼠與豬的海馬切片，通過染色后對其成體神經(jīng)發(fā)生和結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析。

1.2.2 免疫組化與免疫熒光染色（漂浮染色）

1.2.2.1 小鼠海馬的BrdU／DCX熒光雙標(biāo)記 ①取BrdU標(biāo)記的小鼠海馬切片，放入2mol／L濃度的HCl中，37℃孵育30min，打開DNA雙鏈，暴露抗原BrdU；②用0.1mol／L硼酸緩沖液沖洗，中和酸性，然后用0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去殘留硼酸，加入一抗羊抗DCX（1∶800），4℃下?lián)u床孵育12h；③PBS充分洗后加入一抗大鼠抗BrdU（1∶800），繼續(xù)4℃下孵育12h；④PBS洗，加入二抗驢抗羊568（1∶300）室溫孵育4h；⑤PBS洗，然后再加入二抗羊抗大鼠488（1∶300），室溫孵育4 h；⑥PBS洗后裱片，熒光保護(hù)劑封片。

1.2.2.2 豬海馬DCX／DAPI、GFAP／DAPI熒光雙標(biāo)記 ①取豬海馬切片，加入一抗羊抗DCX（1∶800）（或兔抗GFAP，1∶800），4℃搖床孵育12h；②用PBS洗，加入熒光二抗驢抗羊568（1∶300）（羊抗兔488，1∶300），4℃搖床孵育12h；③PBS洗后用DAPI（1∶500）復(fù)染核15min，PBS洗去殘留 DAPI；④裱片，熒光保護(hù)劑封片。

1.2.2.3 豬和小鼠DCX－DAB、NeuN－DAB的免疫組織化學(xué)染色 ①取不做處理小鼠和豬的切片，放入30mL／L H2O2中孵育10min，封閉切片內(nèi)源性過氧化物酶活性；②PBS洗后加入一抗羊抗DCX（1∶800）（或小鼠抗 NeuN，1∶800），4℃下?lián)u床孵育12h；③然后PBS洗去殘留一抗，加入生物素偶聯(lián)的二抗兔抗羊（或羊抗小鼠），4℃搖床孵育12h；④PB洗后，加入鏈霉菌抗生物素蛋白結(jié)合的過氧化物酶室溫?fù)u床孵育1h；⑤PB洗后，以DAB試劑盒顯色；⑥洗去殘留顯色液后，硫堇復(fù)染10min，然后用750mL／L酒精洗去浮色；⑦脫水透明后中性樹膠封片。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 對5只不做任何處理小鼠與3頭豬海馬進(jìn)行切片后，每只動物各取10張切片，從單位齒狀回長度新生神經(jīng)元個數(shù)、新生神經(jīng)元胞體面積及其相對樹突長度（顆粒細(xì)胞層下層至海馬裂的距離）三個方面進(jìn)行統(tǒng)計分析。用Photoshop CS3軟件處理圖片，借助Images J，GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 以DCX標(biāo)記技術(shù)來研究動物的成體神經(jīng)發(fā)生的可行性

BrdU作為一種核苷酸類似物可以整合到新生細(xì)胞的DNA鏈中，BrdU在體內(nèi)代謝時間大約只有2h，因此每一次BrdU注射均只標(biāo)記在BrdU注射后2h內(nèi)新生的細(xì)胞，然后通過抗BrdU抗體免疫組化技術(shù)就可顯示被標(biāo)記的這些新生細(xì)胞。

以BrdU標(biāo)記的小鼠切片進(jìn)行染色，所得結(jié)果如圖1所示，圖1A中箭頭所指的綠色細(xì)胞為BrdU標(biāo)記的新生的細(xì)胞，圖1B中箭頭所指的紅色細(xì)胞為DCX標(biāo)記的未成熟的神經(jīng)元，圖1C中上方箭頭所指的黃色細(xì)胞為2種標(biāo)記物同時標(biāo)記的細(xì)胞，表示這個新生的細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，而下方箭頭所指的綠色細(xì)胞表示沒有向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的新生細(xì)胞，這證明DCX標(biāo)記方法可以把向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的新生細(xì)胞標(biāo)記上，而新生神經(jīng)元的增殖情況可以直接反映成體神經(jīng)發(fā)生的情況，因此，DCX標(biāo)記技術(shù)可以作為一種研究成體神經(jīng)發(fā)生的手段。

2.2 成年小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生特點及其新生神經(jīng)元突觸聯(lián)系的建立

DCX標(biāo)記顯示成年小鼠海馬顆粒細(xì)胞層下層存在著神經(jīng)發(fā)生，源源不斷的產(chǎn)生新的神經(jīng)元，這些新生神經(jīng)元分布相對比較松散，軸突、樹突及其分支清晰可見，延伸方向明確，新生的神經(jīng)元通過樹突及軸突的延伸到固定位置建立起新的突觸連接，借此整合到已存在的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)體系中并行使一定的功能，具體是新生神經(jīng)元的樹突穿過顆粒細(xì)胞層延伸到分子層終止于海馬裂，而軸突通過門區(qū)與CA3區(qū)內(nèi)側(cè)的錐體細(xì)胞建立起突觸聯(lián)系（圖2）。

2.3 成年豬海馬神經(jīng)發(fā)生特點及其與小鼠的差異

對比分析兩種動物所染切片，小鼠海馬齒狀回呈圓滑的C型，而豬的呈現(xiàn)有2個突起的不規(guī)則C型，在形狀上有一定的差異，和小鼠一樣，豬海馬的神經(jīng)發(fā)生同樣位于齒狀回顆粒細(xì)胞層下層，如圖2和圖3。從單位齒狀回長度新生神經(jīng)元個數(shù)、新生神經(jīng)元胞體面積及其相對樹突長度（小鼠與豬新生神經(jīng)元胞體起始于顆粒細(xì)胞層下層，樹突伸入齒狀回分子層，最長終止于海馬裂，因此以顆粒細(xì)胞層下層至海馬裂的距離間接反映新生神經(jīng)元樹突長度）三個方面，對兩種哺乳動物的神經(jīng)發(fā)生的情況進(jìn)行對比分析，三方面差異均顯著，如圖4。圖4A顯示豬海馬齒狀回100μm長度內(nèi)平均有新生神經(jīng)元18.3個，而小鼠的為10.3個；圖4B顯示豬新生神經(jīng)元胞體平均面積為48.9μm2，小鼠的為86.9 μm2；圖4C顯示豬新生神經(jīng)元相對樹突長度為451.4μm，小鼠的為275.6μm。

圖1 成年小鼠海馬齒狀回BrdU／DCX免疫熒光雙標(biāo)Fig.1 BrdU／DCX immunofluorescence double labeling of the adult mouse dentate gyrus

圖2 成年小鼠海馬DCX－DAB免疫組織化學(xué)染色Fig.2 DCX－DAB immunohistochemical staining of adult mouse hippocampus

圖3 成年豬海馬DCX－DAB免疫組織化學(xué)染色Fig.3 DCX－DAB immunohistochemical staining of adult pig hippocampus

圖4 小鼠與豬齒狀回部位新生神經(jīng)元三種參數(shù)對比示意圖Fig.4 Three parameter comparison diagrams of dentate gyrus region＇s newborn neurons between mouse and pig

2.4 豬海馬結(jié)構(gòu)分層與細(xì)胞構(gòu)筑

同小鼠一樣，豬海馬大體上亦由齒狀回和海馬本部兩部分組成，二者均含有一個明顯的細(xì)胞層，小“c”型的齒狀回位于海馬最內(nèi)側(cè)，大“C”型的海馬本部包在齒狀回外側(cè)。海馬本部從腦室面至海馬裂依次為室床（alveus）、始層（stratum oriens）、錐體細(xì)胞層 （stratum pyramidale）、輻 射 層 （stratum radiatum）和腔隙分子層（stratum lacunosum－molecu－lare），如圖5F。海馬本部主要細(xì)胞為錐體細(xì)胞，構(gòu)成錐體細(xì)胞層，大致分為CA1區(qū)和CA3區(qū)，CA1、CA3區(qū)的錐體細(xì)胞特點鮮明，細(xì)胞胞體比較密集地排成一條帶，胞體呈錐形或梭形，突起極性一致，頂部朝向分子層發(fā)出一個粗大的頂樹突，如圖5A，5B，5C；海馬齒狀回為三層結(jié)構(gòu)，由海馬裂向內(nèi)依次為分子層（molecular layer）、顆粒細(xì)胞層（granule cell layer）和多形層（polymorphic cell layer）。分子層中主要含有來自顆粒細(xì)胞的樹突及分支，分子層細(xì)胞很少，主要是一些散在的中間神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；顆粒層主要由大量密集排列的顆粒細(xì)胞胞體構(gòu)成，胞體大多呈卵形，顆粒層靠近門區(qū)一側(cè)的細(xì)胞排列較緊密而整齊，如圖5G，為成體神經(jīng)干細(xì)胞的存在位置，是成體神經(jīng)發(fā)生的起始位點，如圖5H；多行層為海馬門區(qū)靠近齒狀回的區(qū)域，其內(nèi)分布著大量的膠質(zhì)細(xì)胞，大小不等，這些膠質(zhì)細(xì)胞突起較短且無極性，發(fā)出許多微小分支，整體上呈絨球狀，如圖5F。

圖5 豬海馬結(jié)構(gòu)的免疫組織化學(xué)染色圖片F(xiàn)ig.5 Immunohistochemical pictures of pig’s hippocampal formation

3 討論

BrdU標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于成體神經(jīng)發(fā)生的研究，但這個技術(shù)存在著一些缺陷[19]：BrdU濃度會隨著細(xì)胞的連續(xù)分裂被稀釋，標(biāo)記效果就會下降，而且高劑量的BrdU會對組織產(chǎn)生毒性，過低的劑量又會導(dǎo)致不完全標(biāo)記，最重要的是BrdU標(biāo)記技術(shù)只能通過注射的方法對活體內(nèi)的增殖細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，而不能進(jìn)行體外標(biāo)記，而且BrdU價格昂貴，因此以此種技術(shù)來研究大型動物的成體神經(jīng)發(fā)生就顯得不太現(xiàn)實。

因此，本研究采用DCX標(biāo)記技術(shù)來對比分析小鼠與豬成體神經(jīng)發(fā)生的特點，突顯豬成體神經(jīng)發(fā)生的與小鼠相比有哪些不同。DCX標(biāo)記技術(shù)具有很多優(yōu)點：DCX作為一種新生神經(jīng)元的標(biāo)記物它既不在神經(jīng)干細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)也不在成熟的神經(jīng)元中表達(dá)，可以從新生神經(jīng)元產(chǎn)生到成熟之前，整個時期都能瞬間地標(biāo)記這些新生神經(jīng)元；在幼體中，DCX表達(dá)只限于發(fā)育中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所有遷移中的神經(jīng)元前體細(xì)胞，在成體，DCX表達(dá)只限于連續(xù)進(jìn)行神經(jīng)發(fā)生的區(qū)域，在其他區(qū)域很少表達(dá)，具有區(qū)域特異性；DCX表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量可以表示齒狀回中細(xì)胞增殖水平，而且，在外界因子的刺激下，仍可以通過DCX表達(dá)細(xì)胞的增加或減少來體現(xiàn)細(xì)胞增殖水平，因此DCX可被用于分析特定區(qū)域，以及在正常和病理條件下的神經(jīng)發(fā)生的水平；并且它不需要預(yù)先對活體內(nèi)的增殖細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可以直接在體外對DCX抗原進(jìn)行定位、定量標(biāo)記[20]。此外，DCX存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過免疫組化染色可以把細(xì)胞胞體顯現(xiàn)出來，進(jìn)而可以對胞體形態(tài)和面積等進(jìn)行分析。因此，DCX標(biāo)記技術(shù)可以作為一種研究大型動物成體神經(jīng)發(fā)生的有效手段。

本試驗通過免疫組化染色和多種雙重免疫熒光標(biāo)記所得結(jié)果表明，在成體豬齒狀回顆粒細(xì)胞層下層也存在著DCX陽性細(xì)胞，即進(jìn)行著成體神經(jīng)發(fā)生。相對小鼠來說，豬海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下層單位長度內(nèi)的新生神經(jīng)元的數(shù)量以及其相對樹突長度都要大于小鼠，但產(chǎn)生的新生神經(jīng)元的胞體體積要明顯小于小鼠，這意味著豬海馬可以在相同的物質(zhì)能量條件下可以產(chǎn)生更多的神經(jīng)元，而更長的樹突意味著這些新生的神經(jīng)元可以與其他成熟的神經(jīng)元建立起更多的突觸聯(lián)系，以上都說明豬海馬部位的成體神經(jīng)發(fā)生的活躍程度要明顯高于小鼠，這都反映了豬腦的發(fā)達(dá)程度要高于小鼠，腦生理活動要比小鼠復(fù)雜。另外，通過 NeuN－DAB和 GFAP／DAPI的染色表明，豬海馬的結(jié)構(gòu)、分層以及細(xì)胞構(gòu)筑與小鼠的大致相同，只是在各個分層的形狀上有所差別，這說明海馬結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中的保守性，以及哺乳動物在進(jìn)化過程的同源性。

本文主要通過免疫組織化學(xué)的方法，對比分析小鼠與豬海馬成體神經(jīng)發(fā)生的異同，并對成年豬海馬結(jié)構(gòu)的分區(qū)、分層以及細(xì)胞構(gòu)筑進(jìn)行了組織學(xué)水平的描述和定義，揭示大型動物豬海馬結(jié)構(gòu)及其成體神經(jīng)發(fā)生的特點，而關(guān)于豬海馬的主要纖維成分、齒狀回的內(nèi)部纖維聯(lián)系、以及齒狀回與外部的纖維聯(lián)系等，還需進(jìn)一步探索。

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