丁光榮，張俊文

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內科 400016）

Barrett食管（Barrett′s esophagus，BE）是可能引發(fā)食管末端及胃食管交接處腺癌的高風險疾病之一［1］，干細胞分化紊亂是其可能的發(fā)病機制，調控干細胞分化的各種轉錄因子和基因突變有可能是食管干細胞腸化生的重要分子基礎。缺氧誘導因子－1α（hypoxia inducible factor－1α，HIF－1α）是細胞應激缺氧時所產(chǎn)生的轉錄激活因子，突變型P53（mtP53）及Insulin－like growth factor－Ⅱ mRNA－binding protein 3（IMP3）與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。三者共同在Barrett食管形成過程中所起作用并少見報道，本文通過研究這3種蛋白在Barrett食管及反流性食管炎中的表達，探討三者在Barrett食管發(fā)生、發(fā)展過程中的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 標本來自本院消化內鏡中心2010年1月至2011年12月胃鏡活檢，經(jīng)病理確診為Barrett食管患者100例。其中男58例，女42例；年齡18～67歲，平均（51.55±11.83）歲。反流性食管炎組織取自同期胃鏡標本，經(jīng)病理證實為反流性食管炎的患者50例，其中男28例，女22例；年齡19～63歲，平均（46.90±13.11）歲，兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2主要試劑 HIF－1α、IMP3兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司，mtP53兔抗人單克隆抗體購自武漢三鷹公司，免疫組織化學SP試劑盒由北京康為世紀公司提供。

1.3檢測方法 每一例標本均行4μm連續(xù)切片，分別進行HIF－1α、mtP53、IMP3免疫組織化學染色（均采用 SP法）和HE染色。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。HIF－1α多克隆抗體稀釋度數(shù)為1∶200，mtP53、IMP3多克隆抗體稀釋度數(shù)為1∶100。

1.4結果判定 HIF－1α、mtP53蛋白以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性，IMP3蛋白以細胞質有棕黃色顆粒為陽性，對各組標本作免疫組織化學染色陽性評分，依照細胞陽性著色程度（抗原含量），陰性（－）著色為0分、淡黃色弱陽性（＋）為1分、淺褐色中等陽性（＋＋）為2分、深褐色強陽性（＋＋＋）為3分。每個視野總分為：（＋）%×1＋（＋＋）%×2＋（＋＋＋）%×3；每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野，最后取均值為該標本的最后得分。分值小于0.5者為陰性，≥0.5～＜1.0者為弱陽性，≥1.0～＜1.5者為中等陽性，≥1.5者為強陽性。同時用Image－pro plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)對切片做蛋白表達的半定量分析。對同一種蛋白表達的不同切片分析時，先選擇一較典型的照片進行光密度校正、光平衡校正、分析環(huán)境選擇、選色，然后按照這一固定的條件分析其余照片。每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野進行照相，每張照片以總光密度（IOD）作為累積光密度，以照片的總面積（Area）作為面積，計算平均光密度（mean density）＝ 總光密度/總面積，作為一張照片的免疫組織化學陽性指數(shù)，5張照片的均值作為一張切片的陽性指數(shù)參與統(tǒng)計分析。

1.5統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件。計量資料以s表示，均數(shù)比較用t檢驗，定性資料用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。參數(shù)間的相關性用pearson相關分析。

2 結 果

2.1HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白陽性表達綜合評分結果 用綜合評分方法對免疫組織化學切片進行分析顯示，HIF－1α在Barrett食管組中弱陽性6例，中等陽性27例，強陽性21例，共54例（占54%），主要集中在腺管部單層柱狀上皮細胞核內，細胞質內也偶呈淡黃色表達，反流性食管炎組中只有7例弱陽性表達，占14%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；mtP53在Barrett食管組中弱陽性16例，中等陽性7例，強陽性6例，共29例（占29%），主要為細胞核內深褐色顆粒，也以腺管細胞為主，反流性食管炎組中弱陽性2例，中等陽性2例，共4例（占8%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IMP3在Barrett食管組中弱陽性6例，中等陽性24例，強陽性15例，共45例（占45%），主要為細胞質中淡黃色到深褐色顆粒，除腺管部表達較多外，基質及周圍表皮細胞中也有少量表達。而在反流性食管炎組中表達較少，只有弱陽性10例（占10%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見封3圖1～6。

2.2HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白陽性表達平均光密度定量分析結果 用Image－pro plus6.0軟件對免疫組織化學照片進行平均光密度定量分析顯示，Barrett食管組中 HIF－1α、mtP53、IMP3表達與反流性食管炎組相比差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達平均光密度值（s）

表1 HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達平均光密度值（s）

＊：P＜0.05，＃：P＜0.01，與反流性食管炎組比較。

組別 HIF－1α 0.35±0.09 0.15±0.14 0.08±0.12 Barrett食管組 0.60±0.09＃ 0.57±0.11＊ 0.42±0.08 mtP53 IMP3反流性食管炎組＃

2.3HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達之間的關系 對100例Barrett食管標本和50例反流性食管炎標本3種蛋白陽性表達的平均光密度值行簡單pearson相關分析和偏相關分析，結果如下：HIF－1α表達與IMP3表達呈正相關（r＝0.910，P＝0.000）；mtP53表達與IMP3表達呈正相關（r＝0.890，P＝0.001）；控制IMP3的偏相關分析顯示，HIF－1α與 mtP53表達之間呈正相關（r＝0.941，P＝0.000）；三者之間均呈正相關性。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)HIF－1α不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關，并能影響多種干細胞的分化過程［2－5］。本研 究發(fā)現(xiàn)，HIF－1α在 Barrett食管黏膜中的表達明顯高于反流性食管炎黏膜組織，表明HIF－1α在食管黏膜被反流物損傷后的修復過程中，可能抑制了食管正常分化程序，激活腸化柱狀上皮的分化程序。因此，認為Barrett食管實際上是食管黏膜組織對局部損傷的一種不完全修復形式，而HIF－1α有可能是參與Barrett化生形成的轉錄因子之一。mtP53可能導致食管腫瘤的發(fā)生［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，mtP53在反流性食管炎組表達和Barrett食管組有顯著差異，表明P53基因在反流性食管炎時已經(jīng)少量突變，隨病情進展，mtP53的表達量增加，認為P53基因突變是Barrett食管的早期基因變化之一。IMP3屬于胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白家族中的成員之一，能促進細胞的異常生長增殖，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，被認為是很多腫瘤非常有價值的診斷和預后指標［7－12］。本研究結果顯示，IMP3在Barrett食管組中表達升高，與反流性食管炎組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明Barrett食管存在細胞異常增殖，并有惡化傾向。

本研究結果顯示，HIF－1α分別與mtP53、IMP3表達之間呈顯著正相關。說明Barrett食管在形成后即存在細胞的異常增殖和惡變傾向，而HIF－1α、mtP53、IMP3之間可能存在著協(xié)同關系，有可能是促進食管多能干細胞向腸化的單層柱狀上皮細胞方向異常分化、并惡性增殖的原因之一。

本研究認為HIF－1α、mtP53、IMP3三者在Barrett食管發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能是Barrett食管形成的始動機制之一。

［1］Sikkema M，de Jonge PJ，Steyerberg EW，et al.Risk of esophageal adenocarcinoma and mortality in patients with Barrett′s esophagus：a systematic review and meta－analysis［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2010，8（3）：235－244.

［2］Moreno－Manzano V，Rodriguez－Jimenez FJ，Acena－Bonilla JL，et al.FM19G11，a new hypoxia－inducible factor（HIF）modulator，affects stem cell differentiation status［J］.J Biol Chem，2010，285（2）：1333－1342.

［3］Jandial R，Chen MY，Ciacci J et al.HIF－1alpha potentiates mesenchymal stem cell mediated osteogenesis by coupling to angiogenesis［J］.Neurosurgery，2011，69（4）：13－14.

［4］Cunningham LA，Candelario K，Li L，et al.Roles for HIF－1alpha in neural stem cell function and the regenerative response to stroke［J］.Behav Brain Res，2012，227（2）：410－417.

［5］Kaufman DS.HIF hits Wnt in the stem cell niche［J］.Nat Cell Biol，2010，12（10）：926－927.

［6］Jankowski JA，Harrison RF，Perry I，et al.Barrett′s metaplasia［J］.Lancet，2000，356（9247）：2079－2085.

［7］Wachter DL，Kristiansen G，Soll C，et al.Insulin－like growth factor II mRNA－binding protein 3（IMP3）expression in hepatocellular carcinoma.A clinicopathological analysis with emphasis on diagnostic value［J］.Histopathology，2012，60（2）：278－286.

［8］Li HG，Han JJ，Huang ZQ，et al.IMP3is a novel biomarker to predict metastasis and prognosis of tongue squamous cell carcinoma［J］.J Craniofac Surg，2011，22（6）：2022－2025.

［9］Lu D，Yang X，Jiang NY，et al.IMP3，a new biomarker to predict progression of cervical intraepithelial neoplasia into invasive cancer［J］.Am J Surg Pathol，2011，35（11）：1638－1645.

［10］Hao S，Smith TW，Chu PG，et al.The oncofetal protein IMP3：a novel molecular marker to predict aggressive meningioma［J］.Arch Pathol Lab Med，2011，135（8）：1032－1036.

［11］Wachter DL，Schlabrakowski A，Hoegel J，et al.Diagnostic value of immunohistochemical IMP3expression in core needle biopsies of pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Am J Surg Pathol，2011，35（6）：873－877.

［12］Shi M，F(xiàn)raire AE，Chu P，et al.Oncofetal protein IMP3，a new diagnostic biomarker to distinguish malignant mesothelioma from reactive mesothelial proliferation［J］.Am J Surg Pathol，2011，35（6）：878－882.