林 力，鄧 碧，壽 鑄，梁 佳，陳鴻雁△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 400016；2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科 401120）

硫鏈絲菌肽（thiostrepton，TST）是一種噻唑類(lèi)抗生素，可從多株青鏈霉菌中分離獲得［1］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)TST可通過(guò)靶向作用于Forkhead box protein M1（Foxm1）轉(zhuǎn)錄因子抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性無(wú)影響；此外，用此類(lèi)抗生素處理不同來(lái)源的人腫瘤細(xì)胞株，可在下調(diào)Foxml基因表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。

Foxm1是一種上調(diào)細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子，屬叉頭框家族（Fox家族）。有研究表明，它與胚胎發(fā)育、再生、衰老和腫瘤發(fā)生等許多病理生理過(guò)程密切相關(guān)［3］。本研究前期工作中發(fā)現(xiàn)Foxm1在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）組織中高表達(dá)，與NPC的分期及轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。因此，本研究從細(xì)胞角度檢測(cè)Foxm1在鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株中的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)TST對(duì)鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株增殖抑制的作用及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤細(xì)胞系 人鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所）。

1.1.2試劑與藥品 RPIM1640（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT，上海華舜生物工程有限公司），二甲亞砜（DMSO，重慶醫(yī)藥股份有限公司），TST（Merck公司），免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、山羊抗兔二抗（北京中杉公司），兔抗人Foxm1多克隆抗體（Santa Cruz公司），Western blot相關(guān)試劑（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HNE－1細(xì)胞接種到含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層黏壁生長(zhǎng)。傳代時(shí)用0.1%胰酶－0.02%EDTA溶液消化，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算成活細(xì)胞數(shù)。

1.2.2TST對(duì)HNE－1細(xì)胞體外抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HNE－1細(xì)胞，胰酶消化，離心，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/mL。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，加入TST，使其終濃度分別為1、2、4、8、12、16μmol/L，每一濃度重復(fù)6孔，設(shè)試劑對(duì)照組及細(xì)胞對(duì)照組，置37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。離心后，小心去除上清液，每孔加無(wú)血清培養(yǎng)液200μL及5mg/mL MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心，吸去上清液，每孔加200μL DMSO，置于振蕩器上振蕩10min，自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)出各孔吸光度值［D（490）］，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3TST對(duì)HNE－1細(xì)胞周期變化的影響 分別將濃度為1、2μmol/L的TST處理細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組，收集HNE－1細(xì)胞，PBS洗滌2次。離心，去上清液，緩慢加入－20℃預(yù)冷的75%乙醇，固定1h。PBS洗滌2次，將等體積的細(xì)胞懸液和PI染液混合，4℃放置30min。將樣品放入流式細(xì)胞儀（FCM）的樣品室，以激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定，并用Modfit LT2.0軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定不同濃度TST作用于HNE－1細(xì)胞48h后Foxm1的蛋白表達(dá) 分別將終濃度為1、2μmol/L的TST處理細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和以PBS代替Foxm1一抗的陰性對(duì)照組。參照免疫組化SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞Foxm1蛋白表達(dá) 將終濃度分別為1、2μmol/L的TST作用HNE－1細(xì)胞48h后，細(xì)胞裂解液提取胞漿蛋白，Bradford法測(cè)定含量后，取等質(zhì)量的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜（220mA 2h）后封閉1h，加入兔抗人Foxm1、β－actin一抗37℃孵育。洗滌后加入羊抗兔二抗孵育2h，TBST液洗滌膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，曝光，成像。用Quantity one分析軟件測(cè)定各條帶光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用s表示，進(jìn)行多組均數(shù)比較的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)TST對(duì)HNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 通過(guò)MTT觀察到，TST對(duì)HNE－1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯。經(jīng)各濃度TST作用48h后，HNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別在8.31%、17.46%、34.28%、58.68%、87.91%、99.05% （表 1）。由此計(jì)算出TST作用于 HNE－1細(xì)胞48h的IC50為4.015 μmol/L。根據(jù)本結(jié)果，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇濃度為1、2μmol/L的TST藥物作用于HNE－1細(xì)胞。

表1 TST作用48h后對(duì)HNE－1細(xì)胞增殖抑制作用的影響（s）

表1 TST作用48h后對(duì)HNE－1細(xì)胞增殖抑制作用的影響（s）

組別 OD490 抑制率（%）

2.2TST對(duì) HNE－1細(xì)胞周期變化的影響 用FCM檢測(cè)TST作用于HNE－1細(xì)胞48h細(xì)胞周期的變化顯示，經(jīng)TST處理的兩組細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞百分率（68.49±3.16%）%、（72.31±2.43）%均高于對(duì)照組（53.91±5.13）%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果還顯示2μmol/L TST組G0/G1期百分率高于1μmol/L TST組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定不同濃度TST作用于HNE－1細(xì)胞48h的Foxm1蛋白表達(dá)量 Foxm1在對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)明顯，不同濃度TST作用于HNE－1細(xì)胞48h的Foxm1蛋白表達(dá)減少，并且TST濃度越大，F(xiàn)oxm1蛋白表達(dá)減少越明顯。利用分析測(cè)量圖像軟件Imagepro－Plus5.0進(jìn)行半定量分析，各濃度TST組的平均光密度值（TST 1μmol/L組：0.207±0.008，TST 2μmol/L組：0.186±0.006）與對(duì)照組（0.224±0.008）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)封3圖1。

表2 TST對(duì)HNE1細(xì)胞周期變化的影響（s，%）

表2 TST對(duì)HNE1細(xì)胞周期變化的影響（s，%）

a：P＜0.05，與空白對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與 TST 1μmol/L組比較。

組別 G0～G1 S G2/M 53.01±5.13 26.66±1.04 20.33±1.03 TST 1μmol/L組 68.49±3.16a18.33±1.13a13.18±2.31a TST 2μmol/L組 72.31±2.43ab 14.18±1.21ab 13.51±2.52對(duì)照組ab

2.4Western blot檢測(cè)不同濃度 TST作用于 HNE－1細(xì)胞48h的Foxm1蛋白表達(dá) 作用48h后對(duì)照組和各濃度TST組均可見(jiàn)明顯的Foxm1蛋白表達(dá)，在經(jīng)TST處理的細(xì)胞上表達(dá)尤其明顯。將各濃度TST組Foxm1/內(nèi)參灰度比值（TST 1 μmol/L組：0.831±0.014，TST 2μmol/L組：0.758±0.026），與對(duì)照組（0.962±0.016）進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)不同濃度TST作用于HNE－1細(xì)胞48h的Foxm1蛋白表達(dá)

3 討 論

鼻咽癌是中國(guó)南方常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，化療是目前晚期鼻咽癌的主要治療方案之一，但由于化療藥物毒副作用大，臨床應(yīng)用受到限制［4］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素協(xié)同作用的過(guò)程，包括病毒感染、致癌物作用、癌基因激活和抑癌基因失活、細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)節(jié)失調(diào)等多個(gè)因素多個(gè)環(huán)節(jié)［5］。隨著腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中新的腫瘤分子機(jī)制的不斷闡明，全新的腫瘤治療策略應(yīng)運(yùn)而生。其中靶向治療是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)［6］。

Foxm1基因是一種增殖特異性基因，與胚胎發(fā)育、衰老、再生和腫瘤等許多病理、生理過(guò)程關(guān)系密切［7］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1在肝癌、基底細(xì)胞癌、乳腺癌 、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8－12］。Foxm1有望成為一種潛在的全新腫瘤治療靶點(diǎn)。另有報(bào)道，TST可特異性抑制乳腺癌細(xì)胞中Foxm1，而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用［7］。

作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1在人鼻咽癌組織中高表達(dá)，并與鼻咽癌的分期及轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。因此，本研究從細(xì)胞角度檢測(cè)Foxm1在鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株中的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)TST對(duì)鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株增殖抑制的作用及與Foxm1相關(guān)的可能機(jī)制，結(jié)果顯示：（1）TST對(duì)HNE－1有明顯的增殖抑制作用，并且隨濃度的增加，增殖抑制作用增強(qiáng)，這與Nicolaou等［13］報(bào)道TST對(duì)肺癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖抑制作用相符。（2）在TST作用后的 HNE－1細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞百分率增加，導(dǎo)致HNE－1細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并且呈劑量依賴(lài)性，這與Koo等［2］報(bào)道TST阻滯乳腺癌細(xì)胞株于G0/G1期是相符的。（3）隨TST濃度的增加，F(xiàn)oxm1蛋白表達(dá)量的表達(dá)逐漸減少；TST對(duì) HNE－1細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過(guò)抑制Foxm1蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，這與Bhat等［14］報(bào)道相符。

綜上所述，TST對(duì)人鼻咽癌HNE－1細(xì)胞株具有較好的體外增殖抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中Foxm1轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)可為Foxm1基因成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)及其特異性抑制劑TST的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

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