秦 宇，王子衛(wèi)，楊寧波，查 郎，朱代亮

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科 400016）

胃癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌占第2位，我國胃癌發(fā)病率在居惡性腫瘤的第1位［1］。近年來雖然外科手術、放療、化療取得長足進步，然而進展期胃癌的5生存率卻不到20%［2］。胃癌的免疫治療及基因治療等也伴隨著分子生物學和基因工程技術的提高而逐漸成為新型的治療方法［3］。國外報道表皮生長因子（EGFR）與胃癌的病理臨床分期、浸潤層次、淋巴轉(zhuǎn)移及預后密切相關［3－5］。以往一直認為胃癌大多為腺癌，對放射線不敏感，故對胃癌很少用放療。隨著放療設備的更新及放療技術的改進，開展術前、術中、術后放療能夠提高療效，放療對胃癌有了新的應用前景。為此本文研究人EGFR顯性負性突變體真核表達載體（pEGFPN1－dnEGFR）對胃癌細胞放療敏感性的影響，尋求提高胃癌放療敏感性的新方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞株SGC－7901和NCI－N87購自中國科學院，質(zhì)粒pEGFP－N1購自美國Clontech公司，質(zhì)粒pEGFPN1－dnEGFR前期試驗已構(gòu)建成功。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司，MTT、DMSO購自Sigma公司。RNAiso Plus、PrimeScript RT、Premix Taq購自 TaKaRa公司；Bax抗體及Cyclin D1抗體購自碧云天公司。配膠試劑盒、蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天，PVDF膜（Millipore，美國）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期細胞進行試驗。將SGC－7901、NCI－87兩種胃癌細胞分別分為3組：未處理組、pEGFP－N1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（空質(zhì)粒組）、pEGFPN1－dnEGFR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（目的質(zhì)粒組）。

1.2.2放療方法 采用60Co放療機（GWGP－80，中國），6MV的X射線，在源皮距為100cm、射野20cm×20cm下對指數(shù)生長期的穩(wěn)定細胞株室溫下分別采用2、4、6、8、10Gy劑量照射，并設立未照射組。

1.2.3MTT法檢測抑制率 將各組細胞（1×105/mL）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μL。每組設3個平行孔。在CO2孵箱中培養(yǎng)72h后每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，棄上清液加入二甲基亞砜，每孔100μL，在微量震蕩儀上輕微震蕩至結(jié)晶物充分溶解。酶標儀檢測570nm處各孔吸光度（A值），抑制率＝（1－實驗組A570/對照組A570）×100%。

1.2.4RT－PCR檢測Bax、Cyclin D1基因表達 引物序列設計如下。Bax基因上游：5′－GCA AAC TGG TGC TCA AGG C－3′，下游：5′－AGA AAC ACC GCC CTC ACG－3′，產(chǎn)物大小189bp；Cyclin D1基因上游：5′－GGA TGC TGG AGG TCT GCG AGG AAC－3′，下 游：5′－GAG AGG AAG CGT GTG AGG CGG TAG－3′，產(chǎn)物大小514bp；β－action基因上游：5′－GCA AAC TGG TGC TC－3′，下 游：5′－GAT CCA CAT CTG GAA－3′，產(chǎn)物大小500bp。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，進入循環(huán)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取5μL產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。Quantity One軟件分析圖片，以各產(chǎn)物與β－action豐度的比值作為表達水平的參數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5Western blot檢測 Bax、Cyclin D1蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白，加適量上樣緩沖液，煮沸變性，配制濃縮膠和4%～12% 的分離膠（內(nèi)參7－actin為5%濃縮膠和8%分離膠），電泳60V30min，160V140min（內(nèi)參60V30min，160 V 90min）。電泳結(jié)束后，22V100min（內(nèi)參15V，15min）恒壓半干轉(zhuǎn)膜，封閉2h，以鼠抗人MMP－2單抗、鼠抗人caspase－3抗體和鼠抗人Cyclin D1抗體作為一抗（1∶100稀釋），4℃反應過夜，PBST洗膜4次，每次20min。再加入兔抗鼠二抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育90min，洗膜同前。采用Pierce化學發(fā)光試劑盒進行顯色。實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用s表示，各組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測X射線照射對各組細胞的抑制影響 相同劑量X射線照射下，目的質(zhì)粒組細胞對X射線敏感性均顯著高于空質(zhì)粒組和未處理組（P＜0.05），空質(zhì)粒組和未處理組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、3。

2.2RT－PCR檢測X射線照射后各組細胞Bax mRNA和Cyclin D1mRNA相對含量 經(jīng)X射線照射后目的質(zhì)粒組的Bax mRNA表達明顯升高，而Cyclin D1mRNA表達則明顯降低（P＜0.05）?？召|(zhì)粒組和未處理組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1、2）。照射后各組細胞的基因相對表達強度，見表4。

2.3Western blot檢測X射線照射后各組細胞Bax蛋白和Cyclin D1蛋白表達水平 經(jīng)X射線照射后目的質(zhì)粒組的Bax蛋白表達明顯升高，Cyclin D1蛋白表達則明顯降低。X射線照射后空質(zhì)粒組和未處理組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3、4）。X射線照射后各組細胞的蛋白表達相對強度，見表5。

表2 SGC－7901細胞經(jīng)X射線照射處理后的抑制率（s，%）

表2 SGC－7901細胞經(jīng)X射線照射處理后的抑制率（s，%）

＊：P＜0.05，與未處理組和空質(zhì)粒組比較。

X射線照射劑量（Gy）未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組＊＊

表3 NCI－N87細胞經(jīng)X射線照射處理后的抑制率（s，%）

表3 NCI－N87細胞經(jīng)X射線照射處理后的抑制率（s，%）

＊：P＜0.05，與未處理組和空質(zhì)粒組比較。

X射線照射劑量（Gy）未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組＊＊

圖1 pEGFPN1－dnEGFR對胃癌細胞株SGC－7901中Bax和Cyclin D1mRNA表達的影響

圖2 pEGFPN1－dnEGFR對胃癌細胞株NCI－N87中Bax和Cyclin D1mRNA表達的影響

表4 兩種胃癌細胞各組基因表達相對強度比較（s）

表4 兩種胃癌細胞各組基因表達相對強度比較（s）

＊：P＜0.05，與未處理組和空質(zhì)粒組比較。

基因SGC－7901 NCI－N87未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組Bax 0.41±0.05 0.34±0.09 1.21±0.15＊ 0.39±0.02 0.48±0.05 1.15±0.09未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組＊Cyclin D1 1.08±0.11 1.11±0.11 0.24±0.04＊ 1.04±0.13 0.98±0.18 0.41±0.07＊

表5 兩種胃癌細胞各組蛋白表達相對強度比較（s）

表5 兩種胃癌細胞各組蛋白表達相對強度比較（s）

＊：P＜0.05，與未處理和空質(zhì)粒組比較。

蛋白SGC－7901 NCI－N87未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組Bax 0.32±0.13 0.26±0.06 0.95±0.09＊ 0.32±0.09 0.24±0.06 0.95±0.21未處理組 空質(zhì)粒組 目的質(zhì)粒組＊Cyclin D1 0.56±0.21 0.61±0.09 0.24±0.07＊ 0.98±0.24 0.89±0.21 0.28±0.15＊

圖3 pEGFPN1－dnEGFR對胃癌細胞株SGC－7901中Bax和Cyclin D1蛋白表達的影響

圖4 pEGFPN1－dnEGFR對胃癌細胞株NCI－N87中Bax和Cyclin D1蛋白表達的影響

3 討 論

EGFR在胃癌組織中的表達率為40%～65%，EGFR信號轉(zhuǎn)導通道參與細胞分裂、侵襲、血管形成等過程［6］。Lieto等［7］和Gennaro等［8］發(fā)現(xiàn)EGFR高表達促使胃癌細胞增殖、凋亡抑制，并與胃癌病理和臨床分期相關。Cunninghem等［9］研究發(fā)現(xiàn)EGFR表達陰性的患者比陽性患者的腫瘤相關死亡相對危險明顯降低。目前，EGFR的生物阻滯劑作為胃癌的治療藥物正逐漸應用于臨床［10－11］。顯性負性策略是指通過基因工程技術獲得特定受體的顯性負性突變體，從而產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)效應［12］。dnEGFR能夠誘導胃癌細胞凋亡，使胃癌細胞侵襲能力降低，對胃癌細胞惡性表型具有部分逆轉(zhuǎn)作用［13－14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，dnEGFR導入人胃癌細胞SGC－7901和NCIN87后，Cyclin D1的基因和蛋白表達水平降低。因此，本研究認為可能dnEGFR與EGFR競爭結(jié)合上皮生長因子（EGF），EGF的缺乏使 GSK－3β激活使 Cyclin D1－CDK4/6含量減少，Cyclin D1表達水平降低。

Li等［15］研究顯示，Bax基因能夠激活Caspase家族啟動凋亡程序，裂解蛋白酶基板和釋放Cyt－c，最終導致染色質(zhì)凝集、細胞核崩解。本研究發(fā)現(xiàn)，dnEGFR目的質(zhì)粒組Bax mRNA/蛋白的表達水平高于未經(jīng)任何處理的野生型細胞，本研究認為可能dnEGFR誘導人胃癌凋亡是通過上調(diào)Bax基因/蛋白的表達水平從而激活Caspase家族來實現(xiàn)的，這從另外一個角度進一步證實了凋亡相關基因在dnEGFR誘導腫瘤細胞凋亡中扮演角色。

本實驗發(fā)現(xiàn)dnEGFR能夠顯著提高兩種胃癌細胞對X射線放療的敏感性。盡管dnEGFR增強放療的具體機制并不明確，但是本研究在體外初步證實了dnEGFR轉(zhuǎn)染兩種胃癌細胞后，胃癌細胞對放療的敏感性顯著提高，抑制胃癌生長和誘導凋亡，這為今后針對dnEGFR的靶向治療以及聯(lián)合放療的研究提供了一定的理論依據(jù)。

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