枸杞功能性成分的提取及其組成的液相色譜分析

王茂山 荀其寧

（濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院，濟(jì)南 250001） （山東非金屬材料研究所，濟(jì)南 250031）

枸杞功能性成分的提取及其組成的液相色譜分析

王茂山 荀其寧

（濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院，濟(jì)南 250001） （山東非金屬材料研究所，濟(jì)南 250031）

對(duì)枸杞子中的水溶性多糖成分進(jìn)行了分離提取及組成分析。采用水提、醇沉等方法提取枸杞子中的多糖成分，用Sevage 法除去蛋白質(zhì)后，用凝膠色譜法進(jìn)行多糖的純化，制備3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)衍生物進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果表明，枸杞多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5 種單糖組成，其含量分別為5.28%，17.87%，38.29%，17.82%，20.74%。

枸杞多糖；液相色譜；單糖組成

枸杞具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為枸杞多糖是枸杞中主要有效成分之一。枸杞多糖是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗氧化［1］、防衰老、增加造血功能、防止遺傳損傷等作用［2，3］。因此枸杞多糖可作為第3代功能性食品的功能因子，并且具有很好的開發(fā)前景［4］。

近年來，隨著人們生活水平的提高，由以治病為主向防病為主的觀念轉(zhuǎn)變，為功能性食品的開發(fā)帶來了良好機(jī)遇。功效明確的枸杞多糖符合新一代功能性食品的要求，枸杞多糖的研究將推動(dòng)枸杞產(chǎn)品向更高層次發(fā)展。目前對(duì)枸杞多糖含量的測(cè)定方法主要有紫外–可見分光光度法［5–8］，如硫酸–苯酚法、硫酸–蒽酮法，3，5-二硝基水楊酸比色法（測(cè)定總糖）。筆者采取一種新的提取工藝得到枸杞多糖精品，即采用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)在堿性條件下與單糖定量縮合生成單糖PMP 衍生物，用常規(guī)的紫外檢測(cè)器和C18烷基鍵合柱，建立適于多糖單糖組成測(cè)定的高效液相色譜法。該法靈敏、快速、準(zhǔn)確，可用于在線大批量樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料

高效液相色譜儀：1260型，配有紫外及蒸發(fā)光檢測(cè)器，C18烷基鍵合柱，美國(guó)安捷倫公司；

電子天平：AB135–S型，瑞士梅特勒公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ–10型，北京松原華興科技發(fā)展有限公司；

循環(huán)式真空水泵：SHZ–3型，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52–3型，金壇市中正儀器制造有限公司；

低速離心機(jī)：TDZ5–WS型，長(zhǎng)沙湘智離心儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：80–1型，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

自動(dòng)分步收集器：BAZ–100型，天津市琛航科技儀器有限公司；

電腦恒流泵：DHL–A型，蘇州江東精密儀器有限公司；

枸杞子：寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，購(gòu)于藥店；

95%乙醇、三氟乙酸、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)、氫氧化鈉、無水乙酸酐、氯仿等試劑：分析純；

鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)單糖：色譜純。

1.2 枸杞多糖的制備及分析條件的選擇

（1）枸杞多糖粗品的制備

稱取枸杞樣品5 g，粉碎后加入約10倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液至pH 11，于100℃水浴提取2 h，重復(fù)4次；合并濾液，于60℃真空濃縮至一定體積，以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇沉淀，過濾；濾渣加5倍體積的丙酮–石油醚混合液(體積比1∶1)，于50～60℃水浴浸提1 h，過濾，得沉淀，于60℃真空干燥1 h，再于90～105℃干燥箱中烘干，得灰白色枸杞多糖粗品。

（2）脫蛋白多糖的制備

取多糖粗品，加蒸餾水充分溶解，用Sevage法脫蛋白［9］，離心，取上清液對(duì)流水透析48 h，再對(duì)蒸餾水透析24 h，無水乙醇沉淀，抽率得沉淀，真空冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。

（3）多糖精品的制備

取適量脫蛋白多糖，加蒸餾水充分溶解，上Sephadex G–75凝膠色譜柱，用蒸餾水洗脫，自動(dòng)分步收集（4.5 mL/管），苯酚－硫酸法檢測(cè)，合并主峰收集管液，60℃真空濃縮，冷凍干燥，得精制的枸杞多糖。

（4）多糖水解

稱取10 mg精制的枸杞多糖樣品于安瓿瓶中，加入2 mL 2 mol/L的三氟乙酸［10，11］，封管后置于120℃干燥箱中水解，2 h后取出冷卻，離心后取上清液，真空濃縮至干，得單糖樣品置于干燥箱中備用。

（5）標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化

稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖各約10 mg，分別加入物質(zhì)的量為上述單糖2倍的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)，調(diào)節(jié)pH值使溶液成堿性，充分振蕩溶解，于60℃水浴反應(yīng)30 min，取出，冷卻到室溫，真空濃縮蒸干，即可進(jìn)行液相色譜分析。

（6）樣品單糖的衍生化

在上述備用的枸杞多糖水解產(chǎn)物中，分別加入物質(zhì)的量為2倍的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)，調(diào)節(jié)pH值成堿性，充分振蕩溶解，于60℃水浴反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，真空濃縮蒸干，即可進(jìn)行液相色譜分析。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：溶劑A為15%乙腈–20 mmol/L乙酸銨水溶液，溶劑B為40%乙腈–20 mmol/L乙酸銨水溶液，流速為1.2 mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取時(shí)水料比

水料比對(duì)提取效果影響較大，隨著水料比升高，多糖得率增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，水料比由15∶1增到20∶1時(shí)，多糖得率僅增加0.14%，多糖得率的增加幅度下降，同時(shí)考慮到水量過大，多糖溶液被稀釋，反而加大后序過程的難度，增加能耗，因此確定水料比為（10～15）∶1。

2.2 多糖水解時(shí)用酸

多糖的水解常用硫酸，其用量不易控制，過多會(huì)導(dǎo)致多糖樣品的炭化而產(chǎn)生雜質(zhì)峰；過少又會(huì)水解不完全。本法采用三氟乙酸可較好地實(shí)現(xiàn)多糖的水解。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖分析

將不同產(chǎn)地的枸杞多糖按照相同方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣記錄色譜圖。比較各產(chǎn)地枸杞中提取的枸杞多糖，確定了共有的指紋峰，并通過對(duì)照品的色譜圖，確定了主要的指紋峰。采用國(guó)家藥典委員會(huì)制定的中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算軟件分析，將全譜導(dǎo)入后，經(jīng)譜圖處理，以軟件自動(dòng)生成的對(duì)照?qǐng)D譜為參照?qǐng)D譜，通過多點(diǎn)校正將譜峰進(jìn)行比較，得到相似度結(jié)果，查看各樣品的相關(guān)性和區(qū)別。

2.4 樣品多糖中各組分的定性分析

根據(jù)各色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)照，可知枸杞多糖水解物液相色譜圖中各峰代表的單糖分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖，分析結(jié)果見圖1及表2。

圖1 枸杞多糖水解產(chǎn)物的液相色譜圖

2.5 枸杞多糖中各單糖組分含量的測(cè)定

組成枸杞多糖的各單糖組分含量的測(cè)定依據(jù)液相色譜面積歸一化方法，由液相色譜檢測(cè)結(jié)果可知，枸杞多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半

表2 各單糖的出峰時(shí)間

乳糖5種單糖組成，其含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 枸杞多糖的單糖含量

3 結(jié)論

（1）PMP與糖類物質(zhì)衍生時(shí)反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物無立體異構(gòu)。兩分子PMP與一分子單糖縮合，生成的衍生物與各單糖的定量關(guān)系明確，線性關(guān)系良好，檢測(cè)靈敏度較高，可同時(shí)檢測(cè)醛糖、酮糖及糖醛酸。PMP衍生物在254 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收，克服了單糖本身沒有紫外吸收的特點(diǎn)，同時(shí)使用紫外檢測(cè)器克服了示差檢測(cè)器靈敏度低，不適用于梯度洗脫的缺點(diǎn)。

（2）采用PMP衍生物液相色譜法進(jìn)行枸杞多糖的組成分析，結(jié)果表明，該方法能較好地實(shí)現(xiàn)枸杞多糖水解產(chǎn)物的衍生，其衍生物制備簡(jiǎn)便、試劑易得，且每種單糖均可得到單一的色譜峰。

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Extraction of Lycium Barbarum L Functional Components and Analysis by Liquid Chromatography

Wang Maoshan
（Hotel Management College of Jinan University， Jinan 250001， China ）
Xun Qining
（Shandong Nonmetallic Material Institute，Jinan 250031， China）

Water-soluble polysaccharide was isolated and extracted from Lycium barbarum L. The components of the water-soluble polysaccharide were identified and quantified by liquid chromatography(LC).The polysaccharide was extracted by water and deposited by ethano1, then the extract was deproteinated by Sevage method and further puri fi ed by Sephadex G–75 column. The results showed that the Lycium barbarum polysaccharide(LBP) contained rhamnose，arabinose，xylose，glucose，galactose，and their content were 5.28%，24.87%，31.29%，17.82%，20.74%，respectively.

Lycium barbarum polysaccharide; liquid chromatography; component

O657.7

A

1008–6145(2012)03–0075–03

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.020

聯(lián)系人：荀其寧；E-mail: xunqining@163.com

2012–03–14