李大吉

（白城師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 吉林 白城 137000）

冷凍精液在目前的畜牧生產(chǎn)中，起著至關(guān)重要的作用。這項技術(shù)不但可以使企業(yè)節(jié)約成本，還將畜禽良種選育工作得到進(jìn)一步執(zhí)行。但由于豬精子對低溫非常敏感，冷凍過程有可能嚴(yán)重?fù)p害精子頂體膜[1]，從而使精液的受精能力低下，對豬凍精產(chǎn)業(yè)受到了極大的阻礙。因此，本研究的目的是通過對冷凍與解凍處理過程中，豬精子質(zhì)量及頂體完整性的數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步優(yōu)化豬精液凍融程序。為日后研究如何更優(yōu)良的保護(hù)凍融精子提供理論依據(jù)。

1 實驗內(nèi)容

1.1 精液的預(yù)處理

采集精液之后，鏡檢活率大于90%，才能用于實驗。精液在室溫靜止半個小時后，棄上清，靜置待用。

1.2 精液的冷凍-解凍

冷凍過程：將托架放到液氮面上，蓋上容器平衡10min。然后將細(xì)管水平擺好放在托架上，使其在液氮面上熏蒸10min，之后迅速浸入液氮內(nèi)保存。

解凍過程：將細(xì)管從液氮中取出，迅速投入37℃的水浴中，解凍60s，待其解凍后，擦干細(xì)管上的水珠，測精液的質(zhì)量。

1.3 精液的品質(zhì)檢查

1.3.1 精子活率的測定

37℃，45s水浴解凍，然后用等溫的解凍液稀釋后，取10μl精液于載玻片上，在顯微鏡下評定精子活率。

1.3.2 精子頂體完整率的測定

將待測精子進(jìn)行姬姆薩染色法染色。制作后用400倍鏡下檢查5個不同視野，計數(shù)200個精子。

1.3.3 精子質(zhì)膜完整性的低滲膨脹測定

待測精液用精子低滲液稀釋調(diào)整密度，取10μl精子懸浮滴于血細(xì)胞計數(shù)板上，在顯微鏡下觀察，計算彎尾精子百分率。

2 結(jié)果與分析

不同甘油濃度對精子質(zhì)量的影響：

從表1中可以看出，以2%和4%甘油濃度對精子預(yù)處理組，凍融后豬精子的質(zhì)量明顯高于對照組和其它濃度組（P＜0.05），其活率分別為36.2%和35.5%；頂體完整率分別為35.4%和35.2%；低滲膨脹率分別為33.8%和34.2%?？梢姖舛葹?%和4%的甘油在凍融過程中可以更有效地保護(hù)精子，使精子質(zhì)量更高，從而提高凍融精子的實際利用價值。

3 討論

凍融過程中不同處理對豬精子質(zhì)量的影響：

表1 不同甘油濃度對精子質(zhì)量的影響（n=12）

每種細(xì)胞都有它理想的冷凍與解凍速率，Mazur等（1972）給出兩條理論原則：（1）冷凍速率太慢時，與冷凍保護(hù)劑接觸時間過長，精子容易受冷凍保護(hù)劑的毒害作用而死亡或遭受破壞；（2）冷凍速率過快時，細(xì)胞內(nèi)液體易導(dǎo)致結(jié)冰現(xiàn)象，對細(xì)胞造成物理或化學(xué)損傷。解凍時的原理恰好相反。在豬精液冷凍過程中，為了保持精子活力和頂體的完整率，理想的冷凍速率推薦為：0.5mL細(xì)管采用30℃/min、3%甘油濃度[2]，或者0.25mL細(xì)管采用50℃/min、1.5%甘油濃度[3]。當(dāng)5mL大型細(xì)管在3.3%甘油濃度下冷凍時，為達(dá)到最佳的解凍效果，冷凍速率應(yīng)較慢，為 16℃/min[4]。

4 結(jié)論

本試驗是將豬精液進(jìn)行冷凍和解凍處理，并對處理后的豬精子質(zhì)量進(jìn)行檢測，然后與新鮮精子蛋白進(jìn)行對比。通過本試驗的完成得出以下結(jié)論：冷凍過程中，添加2%或4%濃度的甘油，可有效提高凍融精子的質(zhì)量。

［1］Rasul Z,Ahmad N,Anzar M.Changes in motion characteristics,plasma membrane integrity,and acrosome morphology during cryopreservation of buffalo spermatozoa.J Androl[J].2001,22(2):278-28.

［2］Sandroe:Suitability of the hypoosmotic swelling test for assessing the viability of cryopreserved sperm[J].Fertil Steril,1996,66(5):793.

［3］Fiser PS.Combined efect of glucerel concentration and cooling velocity on motihy and acrosomal integrity of boar spermatozoa frozen in 0.5 ml straws[J].Mol Reprod Dev,1990,25:123-129.

［4］Woelders H,Den Besten.Cryopreservation of boar semen with small betweenboar variation of post-thaw sperm survival[J].Cryobiology,1993,30:645.