李秀涼，田麗爽，張玉娟，竇海艷

（1.黑龍江大學 生命科學學院，哈爾濱 150080；2.微生物黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；4.哈爾濱學院 理學院，哈爾濱 150086）

0 引 言

固定化細胞的方法很多，其中以包埋法最為常見[1－2]。包埋法中海藻酸鈣包埋應(yīng)用最為廣泛[3]，最初，研究較多的海藻酸鈣／殼聚糖固芯微膠囊，但由于固芯結(jié)構(gòu)的空間位阻使細胞生長受到一定影響，而液芯海藻酸鈣包囊固定化方法是將細胞包裹在一層半透膜包圍的液態(tài)環(huán)境中，使其不僅具有海藻酸鈣凝膠固定化方法的眾多優(yōu)點，而且此包囊具有更好的傳質(zhì)性能；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的進出更容易；固定化空間更大，細胞在液芯的環(huán)境中生長較均勻，空間位阻較小，能夠高濃度生長[4－7]，有利于固定化發(fā)酵周期長的菌株。

本文通過殼聚糖覆膜改進液芯海藻酸鈣包囊的制備，即選擇了海藻酸鈉－羧甲基纖維素鈉／氯化鈣－殼聚糖復(fù)合載體，通過響應(yīng)面法優(yōu)化該液芯包囊的制備條件，以期獲得機械壓力較高的液芯包囊，延長其使用壽命。利用掃描電鏡觀察液芯包囊的微觀結(jié)構(gòu)，為細胞液芯包囊固定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為食品級；殼聚糖、氯化鈣等均為分析純。

90-1恒溫磁力攪拌器（上海精科有限公司）；AB104-N電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HNY-1102C搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；TA-XT質(zhì)構(gòu)分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈣液芯包囊的制備方法

將羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液與CaCI2溶液以4∶1的比例混勻，滴入海藻酸鈉（SA）溶液中進行凝膠反應(yīng)，過濾出液芯包囊，洗滌，轉(zhuǎn)移到2%CaCI2溶液中進行硬化處理，過濾洗滌包囊，轉(zhuǎn)移到殼聚糖溶液中進行包覆，過濾洗滌后于生理鹽水中4℃下保存待用。

1.2.2 液芯包囊機械壓力的測定

采用質(zhì)構(gòu)分析儀測量包囊的機械壓力，以包囊正面所能承受的最大壓力來表征包囊的機械壓力。同一批包囊隨機取20個，用破裂壓力的平均值作為其機械壓力[5]。

1.2.3 液芯包囊微結(jié)構(gòu)的測定

采用電鏡掃描儀觀察包囊膜的微結(jié)構(gòu)。首先用液氮將包囊冷凍5min，然后將其破碎；放入pH＝6.8的戊二醛中固定并置于4℃冰箱中；再用磷酸緩沖溶液沖洗；選用乙醇逐級脫水；100%的乙醇∶叔丁醇＝1∶1（v／v），純叔丁醇各一次進行置換；將樣品放入－20℃冷凍30min，再進行干燥；將樣品用導(dǎo)電膠帶粘貼在樣品臺上；用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍金；將處理好的樣品放入樣品盒中待檢。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用N＝8的Plackett-Burman實驗設(shè)計[8]，對CaCl2濃度／（%，W／V）、CMC濃度／（%，W／V）、SA濃度／（%，W／V）、凝膠反應(yīng)時間／min、CaCl2中硬化時間／min、殼聚糖的濃度／（%，W／V）6個影響因素進行考察，確定影響包囊機械壓力的顯著因子。對制備包囊的每個影響因素分別取高低兩個水平，以機械壓力作為響應(yīng)值Y。

1.3.2 最陡爬坡實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗篩選出的包囊機械壓力的主要因素，按文獻 [9]做最陡爬坡實驗。

1.3.3 響應(yīng)面分析設(shè)計

3.根據(jù)企業(yè)自身情況進行稅務(wù)籌劃，從而減輕企業(yè)資金成本。在企業(yè)進行采購時，應(yīng)保持與供應(yīng)商協(xié)商與交流，以利益最大化為原則，平衡商品單價與稅額。采購前應(yīng)認真挑選供應(yīng)商，并取得合法、合規(guī)的增值稅專用發(fā)票，確保開票單位與收款單位的統(tǒng)一，從規(guī)避違法、違規(guī)等涉稅行為，避免法律風險。

在Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化。采用Box-Behnken實驗設(shè)計來確定試驗點[10]，通過SAS分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，獲得二次響應(yīng)面回歸模型，確定影響包囊制備顯著因素的最佳值。確定模型可行性后，得出制備包囊最佳條件時的機械壓力，并進行模型驗證實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗確定顯著影響因子

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman實驗設(shè)計對影響包囊機械壓力的6個主要因素進行考察，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1，表2。

表2 Plackett-Burman實驗因素及分析結(jié)果Table2 Factors levels and analysis of the result for Plackett-Burman design

由表2的分析結(jié)果可知，凝膠反應(yīng)時間（X5）、SA濃度（X3）和CMC濃度（X2）為顯著影響因素，且在95%置信區(qū)間其可信度分別為99.2%、98.9%和96.1%。

由Plackett-Burman實驗結(jié)果分析所得的一次回歸方程為：

2.2 最陡爬坡實驗

由Plackett-Burman實驗結(jié)果可知，以海藻酸鈣包囊的機械壓力為測定指標，凝膠反應(yīng)時間、SA濃度有顯著正效應(yīng)，CMC濃度有顯著負效應(yīng)，其它因子均無顯著影響。最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table3 Design and results of steepest ascent experiment

由表3實驗結(jié)果分析可知，隨著CMC濃度降低、SA濃度增加和凝膠反應(yīng)時間延長，機械壓力的變化趨勢是先上升后降，最大機械壓力出現(xiàn)在第3組和第5組之間，所以選取第4組的條件為實驗中心點，進行響應(yīng)面分析。

2.3 響應(yīng)面分析設(shè)計

應(yīng)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，在最陡爬坡實驗基礎(chǔ)上，設(shè)計三因素三水平實驗（表4），并利用SAS分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken實驗的因素與水平Table4 Box-Behnken test factors and level

通過SAS的RSREG（響應(yīng)面回歸）過程進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，獲得擬合二次多項式回歸方程：

其中的X1、X2、X3分別代表海藻酸鈣包囊的CMC濃度、SA濃度和凝膠反應(yīng)時間。

對擬合二次多項式回歸方程的系數(shù)和概率進行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Table5 Program and test results of RSA

表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計Table6 Estimated value of coefficient in the regression equation

由表6分析可知，模型的回歸P＝0.001688，說明該模型的概率在a＝0.01的水平上差異顯著；擬合不足P值＝0.568116＞0.05，說明該模型失擬不顯著，所以該模型可以用于海藻酸鈣包囊制備的最佳條件的理論預(yù)測。模型的復(fù)數(shù)關(guān)系數(shù)R2＝0.9752，說明模型的擬合度很好；其校正決定系數(shù)R2（adj）＝0.9307，表明有約為0.07的機械壓力變異不能由該模型進行解釋。

由表6分析還可知，CMC濃度及二次項對機械壓力的影響比較顯著，而SA濃度和凝膠反應(yīng)時間對機械壓力的影響不顯著，交叉項不顯著。

求解回歸方程，得到CMC濃度、SA濃度和凝膠反應(yīng)時間的最大預(yù)測值分別為1.08%、0.66%、21.19min（圖1～圖3）。此時機械壓力的最大預(yù)測值為15.46N。

圖1 CMC濃度和SA濃度對機械壓力影響的立體分析圖及等高線圖Fig.1 Three-dimensional contours and the corresponding were of CMC concentration and the concentration of SA mechanical pressure

為了進一步驗證實驗結(jié)果，在優(yōu)化條件下進行重復(fù)實驗3次，測得機械壓力平均值為15.32N。與機械壓力的最大預(yù)測值15.46N比較吻合，證明響應(yīng)面分析法優(yōu)化海藻酸鈣包囊獲得的回歸方程的可靠性。

2.4 包囊膜的微結(jié)構(gòu)分析

用掃描電鏡對包囊橫切面進行了觀察，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，海藻酸鈣包囊的切面是致密的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，微孔比較致密，且存在著一定的孔隙。由于包囊內(nèi)部為液態(tài)，這樣的結(jié)構(gòu)為固定化細胞的棲居和繁殖提供了良好的微環(huán)境。

3 結(jié) 論

通過Plackett-Burman實驗設(shè)計與響應(yīng)面軟件設(shè)計分析，得知影響SA-CMC／CaCl2－CA 液芯包囊制備的主要因素為CMC濃度、SA濃度和凝膠反應(yīng)時間，優(yōu)化的最佳值分別為：CMC濃度1.08%，SA 濃度0.66%，凝膠反應(yīng)時間21.19 min。此時機械壓力的最大預(yù)測值為15.46N，與實際值15.32N接近。掃描電鏡結(jié)果表明包囊具有致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

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