鄒金發(fā)，劉曉光，齊鳳杰，葉麗平

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室;2.病理教研室;3.病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州121001;4.遼寧省錦州市95905部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，遼寧錦州 121001)

肝性疾病目前呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的健康。到目前為止，還無法徹底治愈大多數(shù)肝病。近年來有研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽所含的有效成分原花青素(procyanidin)具有抗氧化和清除氧自由基的能力［1－2］。國內(nèi)外研究證實(shí)葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)可抑制血脂，保護(hù)缺血心肌，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，對(duì)腫瘤細(xì)胞等也有不同程度的抑制作用［3－5］。但 GSP對(duì)實(shí)驗(yàn)性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用在國內(nèi)外研究不多。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制小白鼠CCl4和酒精性肝損傷模型，探討GSP對(duì)小鼠化學(xué)性肝損傷的影響，為保肝護(hù)肝藥物的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

動(dòng)物:清潔級(jí)，雄性昆明小鼠140只，體質(zhì)量18～22 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 (合格證號(hào):［SYXK(遼)2003-0011)］。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22±2℃，濕度控制在50% ～75%。

主要試劑:葡萄籽原花青素(西安天豐生物科技有限公司)，SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及復(fù)制急性肝損傷模型

1.2.1 CCl4肝損傷模型:70只小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別設(shè)對(duì)照組、CCl4肝損傷模型組、5個(gè)GSP劑量組。對(duì)照組和模型組每天灌胃相同劑量0.9%氯化鈉注射液，GSP組按劑量灌胃(10、20、50、100和150 mg/kg)。7 d后除對(duì)照組外，其余各組腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液(10 mL/kg)，17 h后檢測(cè)。

1.2.2 酒精性肝損傷模型:70只小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別設(shè)對(duì)照組、酒精性肝損傷模型組、5個(gè)GSP劑量組。對(duì)照組和模型組每天灌胃相同劑量0.9%氯化鈉注射液，GSP劑量組處理同1.2.1。2 h后除對(duì)照組外，其他各組灌胃40%乙醇溶液 (12 mL/kg)，連續(xù)30 d。末次灌胃后禁食12 h檢測(cè)。

1.3 SOD、MDA含量檢測(cè)

取肝臟用冷0.9%氯化鈉注射液制成10%肝組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)肝組織勻漿過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.4 ALT AST含量檢測(cè)

小鼠斷頭取血分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)含量。

1.5 HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GSP對(duì)CCl4肝損傷性小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影響

成功復(fù)制小鼠CCl4肝損傷模型。與對(duì)照組比較，模型組 SOD活性顯著降低，MDA、ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。GSP干預(yù)組呈劑量依賴性顯著緩解或減輕上述變化(P＜0.010)(表1，2)。

表1 GSP對(duì)CCl4肝損傷性小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表1 GSP對(duì)CCl4肝損傷性小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±41 16.7±3.1 model 265±25* 74.3±5.1*GSP(10 mg/kg) 301±25# 53.5±4.0##GSP(20 mg/kg) 374±11## 50.4±0.5##GSP(50 mg/kg) 407±11## 41.7±4.0##GSP(100 mg/kg) 580±16## 34.9±2.9##GSP(150 mg/kg) 628±36## 33.6±3.3##

2.2 GSP對(duì)酒精性肝損傷小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影響

成功復(fù)制小鼠酒精性肝損傷模型。與對(duì)照組比較，模型組 SOD含量顯著降低，MDA、ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。GSP干預(yù)組呈劑量依賴性顯著緩解或減輕上述變化(P＜0.01)(表3，4)。

表2 GSP對(duì)CCl4肝損傷性小鼠血清中ALT和AST含量的影響Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表2 GSP對(duì)CCl4肝損傷性小鼠血清中ALT和AST含量的影響Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 4 009±140* 4 737±139*GSP(10 mg/kg) 2 573±75# 3 625±127#GSP(20 mg/kg) 2 082±92# 3 315±68#GSP(50 mg/kg) 9 801±28# 2 623±103#GSP(100 mg/kg) 341±16# 1 166±97#GSP(150 mg/kg) 318±6# 665±16#

表3 GSP對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表3 GSP對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±42 16.7±31 model 225±19* 61.4±4.6*GSP(10 mg/kg) 277±14# 56.1±2.1#GSP(20 mg/kg) 295±15## 50.5±0.9##GSP(50 mg/kg) 344±12## 41.7±2.7##GSP(100 mg/kg) 406±15## 32.4±4.9##GSP(150 mg/kg) 469±16## 25.0±1.5##

表4 GSP對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中ALT和AST含量的影響Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表4 GSP對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中ALT和AST含量的影響Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 272±21* 590±22*GSP(10 mg/kg) 267±24 389±10#GSP(20 mg/kg) 217±40# 335±14#GSP(50 mg/kg) 154±8# 271±17#GSP(100 mg/kg) 116±8# 220±7#GSP(150 mg/kg) 83±8# 190±27#

2.3 肝臟組織的形態(tài)學(xué)改變

鏡下可見對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉規(guī)則，中央靜脈周圍肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞間及匯管區(qū)周圍無炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。CCl4肝損傷模型組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松化，可見明顯的水樣變性、點(diǎn)灶狀壞死及橋接壞死，匯管區(qū)伴大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。酒精性肝損傷模型組小葉中央?yún)^(qū)部分肝細(xì)胞發(fā)生水樣變性及脂肪變性，并見少量點(diǎn)灶狀壞死，匯管區(qū)伴大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，GSP組肝臟組織變性及壞死程度均減輕(圖1)。

3 討論

目前，對(duì)于傳染性病毒性肝炎是可以通過接種疫苗進(jìn)行預(yù)防，而酒精性及藥物性肝損傷只能通過保肝護(hù)肝食品或者保健品來滋養(yǎng)防范。因此，研究者在不斷地尋找天然的、安全的及有效的且物美價(jià)廉的保肝護(hù)肝產(chǎn)品。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提煉出來的，而葡萄籽是生產(chǎn)葡萄食品、榨汁和葡萄酒業(yè)的廢棄部分，既物美價(jià)廉又很容易得到，因此對(duì)于開發(fā)保肝護(hù)肝藥物有很好的前景。

圖1 肝臟組織的病理變化Fig 1 Pathological change in the hepatic tissue(×400)

本研究采用兩種小白鼠肝臟損傷模型來探討GSP的保肝護(hù)肝作用。CCl4是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型的毒劑，CCl4致毒機(jī)制為經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成自由基·CCl3攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化，自由基·CCl3繼而與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞［6］。而機(jī)體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，乙醇可使α-磷酸甘油增多而促進(jìn)三酰甘油合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，同時(shí)乙醇能激活氧分子產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭，同時(shí)研究證實(shí)，酒精中毒可以直接引起肝臟纖維化，并直接進(jìn)入肝硬化［7］。這兩種肝損傷模型均可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清ALT、AST的升高和肝組織勻漿中SOD下降、MDA增加以及肝組織結(jié)構(gòu)的病理改變，并且重復(fù)性好。故本實(shí)驗(yàn)采用這兩種肝損傷動(dòng)物模型。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，其含量變化間接反映氧自由基含量的變化，從而反映細(xì)胞損傷的程度。SOD是一種帶負(fù)電荷的金屬酶，是體內(nèi)重要的自由基清除劑，肝臟損傷后產(chǎn)生的大量自由基可以消耗SOD，使SOD水平下降，其含量變化可反映機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力［8］。通過GSP對(duì)兩種小白鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用研究可以看出，GSP在一定劑量下，對(duì)肝臟損傷有很強(qiáng)的保護(hù)作用。GSP是由兒茶素和表兒茶素為單位聚合而成的多酚類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化性和清除各種氧自由基的能力，主要是通過清除氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化來完成的［9－10］，但是否還存在其他的保護(hù)肝臟的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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