強(qiáng)北平，Bradley Strauss

冠狀動(dòng)脈慢性全梗阻(CTO) 是指梗阻3 個(gè)月以上，冠狀動(dòng)脈造影TIMI 分級(jí)為0 或1 級(jí)的病變。CTO 病變極為常見，約占冠心病患者的30%左右［1］。臨床研究表明，CTO 的成功再通治療，能顯著改善患者心絞痛癥狀，左室功能，減低冠心病死亡率［2］。針對(duì)CTO 的介入再通治療，約占全部PCI (Percutaneous Coronary Intervention) 的8% ～15%，CTO 介入治療成功與否的關(guān)鍵是能否將導(dǎo)引鋼絲通過病變，達(dá)到CTO 的遠(yuǎn)端。在過去的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，幾乎所有的努力都集中在使用更為堅(jiān)硬的導(dǎo)引鋼絲。但由于CTO 纖維瘢塊中存有大量的膠原纖維和鈣化，使纖維瘢塊極其堅(jiān)硬，導(dǎo)引鋼絲往往極難通過，其介入治療成功率僅在60%左右［3］。這促使我們?cè)噲D尋找一種將CTO 中纖維瘢塊軟化，以利于導(dǎo)引鋼絲通過CTO 病變的方法。

膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix Metalloproteinase，MMP) 的一種，其主要作用是降解基質(zhì)中的膠原纖維。CTO瘢塊的主要組成成分是膠原纖維，是導(dǎo)引鋼絲通過CTO 病變的主要障礙。本實(shí)驗(yàn)室在過去的10 年中利用實(shí)驗(yàn)性CTO 動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)膠原酶能降解CTO 瘢塊中的膠原纖維軟化纖維瘢塊顯著性的改善導(dǎo)引鋼絲通過CTO 病變的成功率； 并對(duì)純化的臨床級(jí)別膠原酶進(jìn)行了劑量和安全性實(shí)驗(yàn)研究。為了進(jìn)一步了解膠原酶對(duì)心肌的影響，向豬的正常冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射不同劑量的膠原酶，發(fā)現(xiàn)在急性期(24h 內(nèi)) 心肌組織有劑量依賴性的灶性出血； 低中劑量很安全，無心肌出血。膠原酶臨床一期劑量和安全性研究已經(jīng)完成，膠原酶治療病例導(dǎo)引鋼絲通過病變的成功率為75%，患者臨床癥狀明顯緩解。進(jìn)一步的臨床實(shí)踐和國(guó)際性合作正逐步展開。

利用實(shí)驗(yàn)性CTO 動(dòng)物模型進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，試圖利用膠原酶軟化纖維瘢塊，促進(jìn)CTO 的介入再通治療。本文在此對(duì)這些實(shí)驗(yàn)研究予以綜述。

1 實(shí)驗(yàn)性CTO 模型的病理特點(diǎn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)多倫多大學(xué)附屬St Micheal's 醫(yī)院和Sunnybrook 醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)同意。家兔股動(dòng)脈CTO 模型制作如曾經(jīng)報(bào)道過的方法［4］，將100U 牛血清凝血酶，注入兩端阻斷的約2cm 長(zhǎng)的股動(dòng)脈段內(nèi)，靜置1h 以形成穩(wěn)定的血栓。然后移去結(jié)扎線，飼養(yǎng)動(dòng)物12 ～15 周后，病變演變?yōu)槁匀Ｗ栌糜谀z原酶的應(yīng)用研究。臨床病理顯示人冠狀動(dòng)脈CTO 內(nèi)有大量的膠原纖維，尤其在CTO 近端，形成所謂“近端纖維帽”，此處是介入治療時(shí)導(dǎo)引鋼絲最難通過處，是介入再通治療的主要障礙之一［5］。組織病理學(xué)研究表明，家兔股動(dòng)脈CTO 模型經(jīng)歷了一個(gè)負(fù)性重塑過程。第2 周時(shí)，梗阻的血栓內(nèi)形成了大量富含蛋白多糖的細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)成片狀沉積，隨后蛋白多糖含量隨時(shí)間逐漸減低，膠原纖維含量則逐漸增高。膠原纖維在第2 周時(shí)尚未出現(xiàn)，到第6 周時(shí)其含量達(dá)10%左右； 至18 周以后其含量已達(dá)15%?？v觀研究顯示，CTO 近端有致密的斑塊狀膠原沉積［6］，這些特點(diǎn)與人冠狀動(dòng)脈CTO 極為相似(見圖1) 。

2 膠原酶

膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase) ，它能在生理pH 和溫度條件下特異性地切割膠原蛋白中甘氨酸殘基的氨基端鈦鍵，從而水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織人體內(nèi)部存在的膠原酶稱為內(nèi)源性膠原酶，對(duì)于體內(nèi)膠原蛋白的分解起著一定的作用。藥用膠原酶是從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取、純化并精制而得的白色或類白色無菌凍干粉針生物制劑，用于水解結(jié)締組織中的膠原成分，其藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)是需要金屬鋅作為輔助因子參與酶解過程。膠原酶目前臨床主要用于Dupuytren 氏病。Dupuytren 氏病是一種手掌內(nèi)膠原纖維病理性增生的疾病，膠原纖維的進(jìn)行性增生形成掌心結(jié)節(jié)和病理性鍵索，造成關(guān)節(jié)攣縮，嚴(yán)重影響手掌功能。局部注射膠原酶，可降解手掌內(nèi)異常增生的膠原纖維，松解指掌關(guān)節(jié)，改善手掌功能［7－8］。膠原酶在心血管疾病的應(yīng)用尚未見其他報(bào)道。

3 膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊的實(shí)驗(yàn)研究

3.1 實(shí)驗(yàn)室級(jí)別膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊，促進(jìn)導(dǎo)引鋼絲通過CTO 實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)室級(jí)別膠原酶(Collagenase Type1A，Sigma) 是從溶組織芽孢桿菌發(fā)酵而來，是包括膠原酶、非特異蛋白酶、梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和氨基肽酶在內(nèi)的多種酶的混合物。分子量在68 ～130KDa 為一般用途的膠原酶。將一直徑3.0mm 的Over－the－wire (OTW) 球囊導(dǎo)管在X 線導(dǎo)引下送至髂總動(dòng)脈，用2 根常規(guī)0.014 的PTCA 導(dǎo)引鋼絲(Wizdom ［Cordis］和Choice PT ［Boston Scientific］) 分2 次試圖通過CTO。如鋼絲未通過CTO 且造影未發(fā)現(xiàn)血管撕裂，CTO 病變則被選入膠原酶應(yīng)用研究。迅速將導(dǎo)管送至CTO 近端，將球囊打至4 個(gè)大氣壓，以形成1 個(gè)在球囊頂端和CTO 近端之間的封閉空間。移去鋼絲，沿OTW 導(dǎo)管將含Type1A 原酶(100μg 或450μg) 總量為1.5ml 的液體注入此空間。最初10例，我們?cè)?膠原酶注入1h 后立即進(jìn)行導(dǎo)引鋼絲穿過試驗(yàn)，均已失敗告終?；谶@樣的經(jīng)驗(yàn)，以后的鋼絲通過試驗(yàn)均在膠原酶注入72h 后進(jìn)行?？偣?5 個(gè)CTO 病變，隨機(jī)行對(duì)照組(24例) 或膠原酶組(21 例) 試驗(yàn)。一期試驗(yàn)： 膠原酶100μg，n=14； 二期試驗(yàn)： 膠原酶450μg，n =31。當(dāng)血管造影顯示導(dǎo)引鋼絲成功穿過CTO 病變，或出現(xiàn)較大的血管撕裂或持續(xù)25min 仍不能通過病變，則終止介入手術(shù)。然后處死動(dòng)物，取出股動(dòng)脈標(biāo)本，做HE 和MOVAT 染色，行組織病理分析。另有6 個(gè)CTO 病變?cè)谧⑸淠z原酶(450μg) 后24h，取出標(biāo)本行膠原酶活性和膠原片段生化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用藥72h后，膠原酶治療組導(dǎo)引鋼絲通過CTO 病變的成功率顯著高于對(duì)照組(62% VS 29%，P =0.028) ； 血管壁撕裂的發(fā)生率兩組并無顯著性差異。組織病理顯示導(dǎo)引鋼絲成功通過的CTO橫切面內(nèi)瘢塊被破壞而且血液充溢開通的血管腔(見圖2) 。內(nèi)彈力膜撕裂的比率，膠原酶治療組和對(duì)照組無顯著性差異(15 ±17%和20 ±24%，P=0.28) 。在450μg 膠原酶治療組可見皮膚表面輕度發(fā)紺。明膠酶譜顯示有明顯增多的92－和82－kDa 的裂解帶，表明僅在膠原酶治療組有MMP－9 酶前體及活性成分(見圖3A) ； 蛋白免疫印記分析表明膠原降解片段也明顯高于對(duì)照組(見圖3B) 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示局部注射膠原酶，能在不破壞動(dòng)脈深層結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，有效的降解CTO 內(nèi)纖維瘢塊的膠原成分，促進(jìn)導(dǎo)引鋼絲通過CTO 病變［4］。

3.2 臨床級(jí)別膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的有效性和毒性研究 為了能將膠原酶在CTO 再通治療中的應(yīng)用推向臨床，我們對(duì)一種臨床級(jí)別的膠原酶的有效性和毒性進(jìn)行了臨床前研究。這種更為純化的膠原酶 (CorCordase，Advance Biofactures，Lynbrook，NY) 包括兩種成分，膠原酶ABC1 和膠原酶ABC2，均從溶組織芽孢桿菌分離純化而來，都是約含1 000 個(gè)氨基酸的多肽鏈，前者分子量為115KD，后者為110KD［9－10］，兩種成分之間無交叉免疫反應(yīng)。這種純化的膠原酶對(duì)各種膠原纖維都有一定水解活性，其強(qiáng)度是實(shí)驗(yàn)室級(jí)別膠原酶的38 倍，而且已經(jīng)用于包括Dupuytren 氏病在內(nèi)的臨床實(shí)踐。依上文所述同樣方法，局部注射150μg 純化膠原酶24h 后，導(dǎo)引鋼絲順利通過所有17 例CTO 病變，其中2 例出現(xiàn)血管撕裂。毒性研究表明，動(dòng)物股部皮膚有劑量依賴性的發(fā)紺出現(xiàn)。注射50μg 時(shí)無發(fā)紺出現(xiàn)，150μg 時(shí)皮膚輕度發(fā)紺，500μg 時(shí)則有嚴(yán)重皮膚發(fā)紺。組織病理并未發(fā)現(xiàn)血管壁結(jié)構(gòu)破壞。明膠酶譜顯示僅膠原酶治療組存在MMP－9 和MMP－2 酶前體及其活性成分；蛋白免疫印記分析表明膠原酶治療組較對(duì)照組有更高的MMP－1 蛋白和膠原降解成分［11］。

3.3 冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射膠原酶后的安全性研究 為了進(jìn)一步了解膠原酶冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后的安全性，我們向正常豬的冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射膠原酶Type1A，以期了解膠原酶對(duì)心臟的毒性反應(yīng)。在X 線引導(dǎo)下，將1 直徑2.0 ～2.5mm 的OTW 球囊導(dǎo)管沿0.014 導(dǎo)引鋼絲送至前降支第二對(duì)角支處，打開球囊至14 個(gè)大氣壓，冠狀動(dòng)脈造影以確定冠狀動(dòng)脈被完全阻斷，然后沿OTW 導(dǎo)管注入(50、100、250、400、600、800、1200、1600和3200μg) 的9ml PBS 液體。8min 后除去球囊導(dǎo)管，行冠狀動(dòng)脈造影。分別于24h 或30d 后處死動(dòng)物，取出心臟作病理切片，以觀察心肌出血，炎癥改變。冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射膠原酶24h后，除球囊擴(kuò)張對(duì)血管壁造成的炎性反應(yīng)外，未見膠原酶對(duì)血管壁的破壞作用。對(duì)照組和低劑量治療組(600μg 以下) ，未見心肌有明顯變化。高劑量組(800 ～3600μg) ，心肌則有明顯的上皮出血，主要集中在右室和左室心尖。顯微鏡下，600～1200μg 組已出血輕度灶性出血，1600 ～3200μg 則出現(xiàn)中度出血。所有標(biāo)本均有輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。到30d 時(shí)，心肌的出血現(xiàn)象已消失，代之以心內(nèi)膜下心肌纖維化(見圖4) 。

3.4 膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊的臨床研究 經(jīng)過近10 年不懈的實(shí)驗(yàn)研究，膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的應(yīng)用實(shí)踐終于于2009 年從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。一期膠原酶劑量安全性研究已經(jīng)完成。共20 例患者，所有患者均經(jīng)至少1 次的PCI 血管再通治療但均以失敗告終?；颊叻? 組，每組5 人； 所用純化的臨床級(jí)別膠原酶劑量分別為300μg、600μg、900μg 和1200μg。膠原酶經(jīng)OTW 球囊導(dǎo)管或fine－cross 導(dǎo)管送至CTO 病變處，持續(xù)約30min。24h 后，患者回到導(dǎo)管室，行PCI 血管再通治療。膠原酶治療后導(dǎo)引鋼絲通過病變的成功率是75%。由于放支架時(shí)造成的側(cè)支缺血，有3 例出現(xiàn)了非ST 段抬高的心肌梗死。3 個(gè)月后CT 血管造影顯示無后續(xù)并發(fā)癥，膠原酶治療成功病例支架仍然開通； 心絞痛癥狀明顯緩解［12］。

CTO 病變目前是介入心臟病學(xué)需要攻克的主要障礙之一，應(yīng)用膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的臨床研究以及多中心的國(guó)際合作正在逐步展開。也許在不遠(yuǎn)的將來膠原酶對(duì)CTO 纖維瘢塊的軟化，就會(huì)成為CTO、PCI 血管再通治療的主要手段之一。

圖1 人冠狀動(dòng)脈CTO 和家兔股動(dòng)脈CTO 模型病理橫切面Figure 1 Pathological transverse coronary CTO and rabbit femoral artery CTO model

圖2 導(dǎo)引鋼絲成功通過CTO 橫切面的組織病理Figure 2 Tissue pathology of guide wire successfully passed the CTO transverse

圖3 膠原酶治療組與對(duì)照組的比較Figure 3 Comparison of collagenase treatment group and control group

圖4 冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射膠原酶后的變化Figure 4 Change of intracoronary injection of collagenase

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