長(zhǎng)春新堿固體脂質(zhì)納米粒的制備工藝優(yōu)化＊

夏愛(ài)曉，孫 淵，馬紅丹

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院藥劑科，浙江 臺(tái)州 317000)

長(zhǎng)春新堿(vincristin，VCR)用于治療急性淋巴細(xì)胞性白血病，療效較好[1]，但神經(jīng)毒性大，且對(duì)光不穩(wěn)定，臨床使用不便。靶向制劑可降低長(zhǎng)春新堿的神經(jīng)毒性，并提高其體外穩(wěn)定性，從而提高療效，這將是今后新劑型的研究趨勢(shì)。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)能將藥物包裹于類脂核中而使藥物穩(wěn)定性增加，并可改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在骨髓、脾、肺和肝等組織器官中積蓄，從而提高藥物的治療指數(shù)，具有緩控釋、靶向、低毒等優(yōu)點(diǎn)[2－3]。筆者在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化處方組成和制備工藝，為開(kāi)發(fā)長(zhǎng)春新堿新型制劑提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，TU－1901型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);N4 PLUS型納米粒度分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);日立H－7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司);AF100 Scotsman型制冷機(jī)(美國(guó)斯科茨曼公司);AL104型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);SB25－120超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);88－1型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器廠);Soniprep 150型超聲細(xì)胞粉碎儀(英國(guó)SANYO公司);pHS－3C pH酸度計(jì)(上海雷磁公司)。硫酸長(zhǎng)春新堿(海南長(zhǎng)春花藥業(yè)有限公司，含量為97.7%);單硬脂酸甘油酯(上海華精生物高科技有限公司);硬脂酸(德國(guó)Cognis公司);大豆卵磷脂(杭州宏博生物工程有限公司);泊洛沙姆188(德國(guó)BASF公司);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 長(zhǎng)春新堿含量測(cè)定(高效液相色譜法)

2.1.1 色譜條件[4]

色譜柱:Hypersil ODS2 C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －水 －三乙胺(140∶60∶1，磷酸調(diào) pH至=7.0);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):297 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取長(zhǎng)春新堿對(duì)照品1.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品貯備液。精密量取5.0 mL置50 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0 μg/mL 的對(duì)照品溶液。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以長(zhǎng)春新堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=12274 C －2682.3，r=0.9999(n=7)。結(jié)果表明，長(zhǎng)春新堿質(zhì)量濃度在0.5～5.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率試驗(yàn):精密量取空白固體脂質(zhì)納米粒2.0 mL共3份，置10 mL容量瓶中，加入對(duì)照品溶液適量，用75%甲醇定容，超聲處理后，得質(zhì)量濃度為 0.5，1.5，5.0 μg/mL 的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，低、中、高3種質(zhì)量濃度溶液的回收率均在98% ～102%之間，平均 RSD為1.6%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好，符合方法學(xué)要求。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為 1.0，2.0，5.0 μg/mL 的對(duì)照品溶液，分別于1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次和5 d內(nèi)每天進(jìn)樣1次。結(jié)果日內(nèi)精密度的 RSD=1.18%，日間精密度的 RSD=1.38%。

2.2 包封率和載藥量測(cè)定[5]

精密吸取長(zhǎng)春新堿固體脂質(zhì)納米粒(VCR－SLN)1.0 mL，置處理過(guò)的透析袋中，兩端扎緊，置50.0 mL的重蒸水中，磁力攪拌2.5 h后，精密量取透析袋外液，測(cè)定其中游離藥物的含量 C1;另外精密吸取等量的VCR－SLN混懸液，75%甲醇定容至刻度，超聲時(shí)納米粒充分破碎，測(cè)定長(zhǎng)春新堿含量 C2。包封率(EE，%)=(1－C1/C2)×100% ，載藥量(DL，%)=(EE% ×Wp)/W總×100%。其中，Wp為制劑中長(zhǎng)春新堿的含量，W總為制劑中脂質(zhì)材料和藥物的總質(zhì)量。

2.3 單因素考察

2.3.1 載體材料篩選

精密稱取基質(zhì)(單硬脂酸甘油酯或硬脂酸)200.0 mg，加熱溶于無(wú)水乙醇，得有機(jī)相;精密稱取大豆卵磷脂100.0 mg，制成水溶液，作為內(nèi)水相，第1次超聲(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含表面活性劑1%泊洛沙姆188)，第2次超聲(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W復(fù)乳，通氮?dú)庀鲁晸]發(fā)有機(jī)溶劑。用超聲細(xì)胞破碎儀于冰浴條件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀釋水相(蒸餾水0～2℃)中，即得。冰箱保存，放置1周，留樣觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果以單硬脂酸甘油酯為載體材料時(shí)無(wú)沉淀現(xiàn)象，略帶藍(lán)色乳光;以硬脂酸為載體材料時(shí)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，較混濁。故選擇單硬脂酸甘油酯作為載體。

2.3.2 乳化劑篩選

稱取單硬脂酸甘油酯200.0 mg，共3份，加熱溶于無(wú)水乙醇，得有機(jī)相，以處方量的大豆卵磷脂水溶液為內(nèi)水相，第1次超聲(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含不同種類乳化劑)，第2次超聲(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W復(fù)乳，通氮?dú)庀鲁晸]發(fā)有機(jī)溶劑。用超聲細(xì)胞破碎儀于冰浴條件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀釋水相(蒸餾水0～2℃)中即得。冰箱保存，放置1周，留樣觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果以卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)為乳化劑時(shí)溶液較透明，略帶藍(lán)色乳光;以卵磷脂－泊洛沙姆188－Tween－80(1∶2∶1)為乳化劑時(shí)溶液略呈黃色，放冷后較混濁;以卵磷脂 －泊洛沙姆188－Tween－80(1∶1∶1)為乳化劑時(shí)溶液略呈黃色，出現(xiàn)少許沉淀，較混濁。因此，選卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)為乳化劑。

2.3.3 制備方法篩選[5－8]

熱熔超聲法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL無(wú)水乙醇，得有機(jī)相，75℃水浴;將水相加熱到與有機(jī)相相同溫度時(shí)注入有機(jī)相中，恒溫?cái)嚢?，制得初?趁熱將初乳超聲，冰水浴冷卻、固化2 h，過(guò)膜，即得。高溫乳化－低溫固化法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL無(wú)水乙醇，得有機(jī)相;有機(jī)相和水相分別水浴加熱至 (75±5)℃，在有機(jī)相完全溶解為澄明液體后，攪拌(1000 r/min)下將其傾入水相中，恒溫?cái)嚢? h，使體積揮發(fā)至原來(lái)的1/3，得初乳;將初乳傾入20.0 mL的1%泊洛沙姆188中，繼續(xù)攪拌1 h，過(guò)膜，即得。

溶劑乳化－超聲法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯，溶于5.0 mL無(wú)水乙醇，得有機(jī)相;在超聲狀態(tài)下，將有機(jī)相趁熱逐滴滴入水相中，通氮?dú)獬晸]盡有機(jī)溶劑制得初乳，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)分散，過(guò)膜，即得。

復(fù)乳－溶劑擴(kuò)散法:精密稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、大豆卵磷脂，溶于無(wú)水乙醇為有機(jī)相，水為內(nèi)水相，第一次超聲乳化，形成 W/O初乳;加外水相(含表面活性劑1% 泊洛沙姆188)，第二次超聲乳化，形成W/O/W復(fù)乳，然后復(fù)乳加入稀釋水相(0～2℃)中，分散機(jī)分散15 min(10000 r/min)，通氮?dú)庀鲁晸]發(fā)有機(jī)溶劑后，用超聲細(xì)胞破碎儀在7 AM振幅下破碎10 min，然后復(fù)乳加入稀釋水相(0～2℃)冷卻固化2 h，過(guò)膜，即得。

采用濁度法初步評(píng)價(jià)各種方法制備的VCR－SLN粒徑的大小，其原理為脂質(zhì)材料和乳化劑等在500～800 nm范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有吸收，不影響透光率，因此用650 nm處的吸光度值作為體系濁度來(lái)間接反映粒子大小。在相同條件下，濁度小者其粒徑較小。結(jié)果見(jiàn)表1。故采用復(fù)乳－溶劑擴(kuò)散法制備VCR－SLN。

表1 不同制備方法結(jié)果比較

2.3.4 破碎振幅和時(shí)間考察

復(fù)乳－溶劑擴(kuò)散法制備的空白固體脂質(zhì)納米粒分成10份，其中 5份分別在 3，5，8，10，15 AM 超聲破碎 6 min，另 5份在 10 AM 下超聲破碎時(shí)間分別為 1，3，6，8，10 min，用濁度法初步評(píng)價(jià)SLN粒子大小。確定超聲破碎時(shí)間為6 min，振幅為8 AM。

2.4 VCR－SLN處方優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)及單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇長(zhǎng)春新堿的用量(因素A)、大豆卵磷脂的用量(因素B)、泊洛沙姆188的用量(因素C)及單硬酸酯甘油酯的用量(因素D)4個(gè)因素的3個(gè)水平，以SLN包封率、載藥量和粒徑為指標(biāo)，優(yōu)化處方[9]。因素水平見(jiàn)表2。根據(jù)以上各因素水平，以VCR－SLN正交L9(34)表進(jìn)行9次試驗(yàn)，測(cè)得平均包封率為36.15%，平均載藥量為1.82%，見(jiàn)表3。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析可知，以包封率為衡量指標(biāo)得出的最佳處方為A3B3C2D2;以粒徑為衡量指標(biāo)得出的最優(yōu)處方為A3B3C2D1，粒徑越小越好。以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，參考粒徑，綜合分析，最終確定A3B3C2D2為最優(yōu)處方，即單硬脂酸甘油酯80 mg，長(zhǎng)春新堿10 mg，大豆卵磷脂100 mg，泊洛沙姆188150 mg。

表2 正交試驗(yàn)的因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 性質(zhì)考察

驗(yàn)證性試驗(yàn):采用復(fù)乳－溶劑擴(kuò)散法，按照優(yōu)化后的處方制備3批 VCR－SLN，測(cè)定粒徑、包封率和載藥量，平均粒徑為(153.7±3.68)nm，包封率為 (55.12 ±1.73)% ，載藥量為(3.09 ±0.61)% 。該方法重現(xiàn)性較好。pH 為 5.69 ～6.22，符合靜脈注射要求。

外觀形態(tài):取VCRSLN適量，加重蒸水稀釋，滴于銅網(wǎng)上，用2.0% 磷鎢酸進(jìn)行染色，自然晾干后，透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)和大小。透射電鏡照片見(jiàn)圖1，所得制劑為球形或類球形，外觀形態(tài)較圓整。

粒度及分布:取VCRSLN混懸液，用高純水稀釋調(diào)至儀器顯示電信號(hào)值，折光度為90°，采用N4 PLUS納米粒度分析儀測(cè)定納米粒粒徑(d)。測(cè)得粒徑為(153.7 ±3.68)nm(n=3)，粒度多分散性指數(shù)(PI)為0.791。

圖1 VCR－SLN透射電鏡照片(×100000)

3 討論

本試驗(yàn)曾嘗試用熱熔超聲法、高溫乳化－低溫固化法、復(fù)乳 －溶劑擴(kuò)散法，溶劑乳化－超聲法等不同方法制備VCRSLN，由于長(zhǎng)春新堿為水溶性，見(jiàn)熱和光易分解，不易采用熱熔和高溫等條件，最終確定復(fù)乳－溶劑擴(kuò)散法，且該方法適合水溶性強(qiáng)藥物，包封率高。若采用高壓勻質(zhì)機(jī)制備水溶性的SLN將更有優(yōu)勢(shì)。

骨架脂質(zhì)的種類是SLN能否形成的關(guān)鍵因素。單硬脂酸甘油酯既可作為一種脂質(zhì)材料，又是一種弱的W/O型乳化劑，在制備SLN初乳時(shí)，能穩(wěn)定初乳。硬脂酸SLN穩(wěn)定性明顯低于單硬脂酸甘油SLN，可能是由于硬脂酸是直鏈分子結(jié)構(gòu)，黏度較大，晶格的有序性較高，在貯存過(guò)程中易發(fā)生晶型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生凝膠化現(xiàn)象[10]。

常用的乳化劑有大豆磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酸酯等，都可用來(lái)穩(wěn)定SLN，在制備復(fù)乳時(shí)，采用泊洛山姆188作為乳化劑。泊洛沙姆188有空間位阻作用，一方面可阻止納米粒的聚集從而增加其穩(wěn)定性，另一方面又有避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的趨勢(shì)[11]。細(xì)胞破碎儀破碎振幅對(duì)固體脂質(zhì)納米粒有顯著影響，在單因素考察中，破碎振幅6 AM，破碎時(shí)間8 min，效果最理想，能得到藍(lán)色乳光SLN，且形成的SLN較穩(wěn)定。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，乳化劑卵磷脂的用量對(duì)SLN粒徑大小影響較大。卵磷脂不僅影響SLN的粒徑，對(duì)載藥SLN的包封率也有較大影響[12]。

SLN包封率測(cè)定方法有葡聚糖凝膠柱法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等，其原理均為采用一定的方法使包封的藥物和游離藥物分離，測(cè)定包封或游離藥物的濃度，計(jì)算包封率。離心法雖然簡(jiǎn)便但不可靠，不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)包封率的大小。本研究也曾嘗試葡聚糖凝膠柱法分離VCR－SLN中的游離藥物，試驗(yàn)中采用蒸餾水作為洗脫劑時(shí)，由于長(zhǎng)春新堿為水溶性，在洗脫過(guò)程中SLN在葡聚糖凝膠中容易洗脫，導(dǎo)致包封率過(guò)高，且操作煩瑣。采用透析法測(cè)定VCR－SLN包封率，考察在透析2 h左右游離藥物基本達(dá)到透析平衡，且在4 h內(nèi)不發(fā)生嚴(yán)重滲漏。為保證透析完全而SLN不滲漏，故選擇2.5 h為其透析時(shí)間。

由于長(zhǎng)春新堿為水溶性，與脂質(zhì)的結(jié)合能力較差，使得VCR－SLN的包封率低于脂溶性好的藥物。對(duì)于水溶性藥物，應(yīng)根據(jù)所載藥物的性質(zhì)選擇與其結(jié)合力好的脂質(zhì)和乳化劑進(jìn)行優(yōu)化，提高藥物的脂溶性，減緩藥物的釋放[13]?？傮w來(lái)說(shuō)，本方法制備SLN較適合水溶性藥物，適用性廣泛。新型給藥系統(tǒng)是改善長(zhǎng)春新堿不良反應(yīng)大、生物利用度低的最好方法。目前，長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體雖已進(jìn)入了臨床研究，但其臨床耐受性及藥物累積毒性仍需密切關(guān)注。如何使長(zhǎng)春新堿達(dá)到更加精確的靶向治療，進(jìn)一步降低其不良反應(yīng)，延長(zhǎng)其作用時(shí)間，將是長(zhǎng)春新堿新型給藥系統(tǒng)不斷的追求。本研究中成功制備了VCR－SLN，制備工藝簡(jiǎn)單，考察制劑質(zhì)量較理想，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)療效好、毒性低的長(zhǎng)春新堿制劑奠定了基礎(chǔ)。

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