萬(wàn)巧鳳，顧立剛，殷勝駿，吳 珺，邱澤計(jì)

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥抗病毒教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004)

甲型流感病毒是具有高度傳染性呼吸道病毒，可引起人和動(dòng)物高發(fā)病率和病死率。在抗流感病毒方面，中藥通過(guò)阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、抗炎等綜合功效而發(fā)揮抗病毒作用。黃芩苷(Baicalin，BAI)是從黃芩(Scutellaria baicalensis)中提取的多酚羥基黃酮類單體，具有抑菌［1］、清除氧自由基［2］、抗腫瘤［3］、抗凋亡［4］等多種作用。本課題組前期做了黃芩苷體外抗流感病毒實(shí)驗(yàn)，表明黃芩苷對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡有抑制作用。黃芩苷(0.96～1.5 g·kg-1)對(duì)流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠死亡有很好的保護(hù)作用［5］。關(guān)于黃芩苷體內(nèi)抗流感病毒的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)制備了小鼠甲型流感病毒性肺炎模型，通過(guò)觀察肺組織病理改變、檢測(cè)肺組織轉(zhuǎn)錄因子AP-1在基因和蛋白兩個(gè)水平的表達(dá)及檢測(cè)肺勻漿炎性細(xì)胞因子分泌水平，初步探討黃芩苷抗流感病毒的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與流感病毒 ICR小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量13～15 g，小鼠及飼料均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):0194690。流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株FM1由中國(guó)中醫(yī)藥研究院中醫(yī)所提供，于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后測(cè)血凝滴度為2-7。測(cè)定其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-3.17，確定造模濃度為2倍LD50。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 黃芩苷，純度92%，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)初正云教授惠贈(zèng);利巴韋林(ribavirin，RBV)顆粒，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)100725。TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)，兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，Agarose(Promega)，DEPC(Sigma)，DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，引物由上海生工生物工程公司合成，c-jun一抗(bioworld，批號(hào) 360858)，P-c-jun/AP-1 一抗(bioworld，批號(hào)360756)。HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)91664)，βactin(Invitrogen公司)，Western blot其它試劑及H-E染色材料由本室配備。ELISA試劑盒(尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)北京有限公司):TNF-α(RB，貨號(hào)2R602)，IL-1β(RB，貨號(hào)2R432)。

1.2 方法

1.2.1 分組及肺炎模型制備 訂購(gòu)ICR小鼠96只，♀♂各半，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，RBV組(100 mg·kg-1)，BAI組(1500、750、375 mg·kg-1)，每組16只，將各組小鼠用乙醚輕度麻醉，正常對(duì)照組以0.05 ml生理鹽水滴鼻，其余各組以0.05 ml的2倍LD50FM1稀釋液滴鼻。

1.2.2 藥物治療及實(shí)驗(yàn)樣本采集 于感染后24 h開(kāi)始灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型組灌同量的蒸餾水，其余各組按相應(yīng)劑量給藥，每天1次，共給藥4 d，d 6禁食禁水8 h，摘眼球放血致死，無(wú)菌摘取全肺。每組隨機(jī)取4只全肺固定于10%的甲醛溶液。其余全肺分為兩半，其中一半制作肺勻漿，另一半存于液氮備用。

1.2.3 肺組織病理切片制作 將固定好的標(biāo)本行石蠟包埋，切片5 μm，經(jīng)H-E染色、中性樹膠封固后顯微鏡觀察照相。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)肺組織c-jun、c-fos mRNA表達(dá)每組隨機(jī)取5只小鼠肺組織進(jìn)行RT-PCR定量實(shí)驗(yàn)。TRIzol提取各組肺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。取3 μg為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2 μl cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為:β-actin(385 bp):上游5'-GGT GTG ATG GTG GGA ATG-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-jun(327bp):上游 5'-CCT GCC TTT GTA AGT TAT TCC-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-fos(263 bp):上游5'-GAG AAT CCG AAG GGA ACG-3'，下游 5'-GGC AGA CCT CCA GTC AAA-3'，PCR反應(yīng)總體積為20 μl，擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸3 min，4℃終止反應(yīng)。RTPCR產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色后用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各目的條帶與β-actin的IOD值，其比值為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)肺組織c-jun、p-c-jun蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)取5只小鼠肺組織進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。將肺組織樣本于液氮中研磨致粉末，加入裂解液，Bradford法蛋白定量。取總蛋白40 μg，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水浴5 min后上樣，SDS-PAGE電泳(濃縮膠80V，分離膠100V)，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(30 mA，90 min);封閉后分別加入c-jun、p-c-jun一抗，4℃過(guò)夜;TBS-T漂洗液洗膜10 min，共3次;加入 HRP標(biāo)記的二抗，37℃振蕩60 min;加入ECL發(fā)光液，X線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析，各目的條帶與βactin的灰度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 肺組織勻漿TNF-α、IL-1β含量測(cè)定 將各組12只肺組織，按參考文獻(xiàn)［6］制備肺勻漿。程序按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BAI對(duì)肺組織病理形態(tài)的影響 H-E染色切片光鏡下觀察結(jié)果:正常對(duì)照組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形態(tài)完整，肺泡壁厚度正常，支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無(wú)分泌物，外周未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組呈現(xiàn)重度間質(zhì)性肺炎病變，肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、細(xì)支氣管等正常的組織結(jié)構(gòu)消失，形成實(shí)變區(qū)，組織間見(jiàn)大量紅細(xì)胞，血管內(nèi)充血。RBV組和 BAI 750、375 mg·kg-1組肺泡、肺泡囊、肺泡管等肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡隔較正常對(duì)照組有所增厚，偶見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及少量血管內(nèi)充血;BAI 1 500 mg·kg-1組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)病變有所改善，但效果不明顯，見(jiàn)Fig 1。

2.2 BAI對(duì)肺組織c-jun、c-fos mRNA表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組c-jun、c-fos mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，RBV和BAI 375 mg·kg-1組c-jun、c-fos mRNA表達(dá)降低(P＜0.01)，BAI 750 mg·kg-1組 c-jun 、c-fos mRNA 表達(dá)降低(P ＜0.05)，BAI 1 500 mg·kg-1組 c-jun 、c-fos mRNA表達(dá)降低(P＞0.05，P＜0.05)，見(jiàn)Fig 2。

2.3 BAI對(duì)肺組織c-jun、p-c-jun蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組c-jun、p-c-jun蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，RBV與BAI 750、375 mg·kg-1組 c-jun、p-c-jun 蛋白表達(dá)降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 p-c-jun蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)、c-jun蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)(P＞0.05)，見(jiàn) Fig 3。

2.4 BAI對(duì)肺組織勻漿炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組TNF-α、IL-1β分泌明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，RBV組及 BAI 750、375 mg·kg-1組 TNF-α 分泌降低(P＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 TNF-α 分泌降低(P＜0.05);RBV 組及 BAI 750、375 mg·kg-1組 IL-1β分泌降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 IL-1β分泌有降低趨勢(shì)(P＞0.05)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

△△P ＜0.01 vs normal group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 TNF-α/ng·L-1 IL-1β/ng·L -1 Normal 143.32±23.72 143.33±24.53 Model 218.30±31.05△△185.98±30.71△△RBV 100 152.07±25.33* 148.56±21.33＊＊BAI 1500 186.19±17.67* 178.32±24.31 750 159.02±25.48＊＊156.69±21.38＊＊375 153.46±25.09＊＊153.61±21.90＊＊

Fig 1 Effect of BAI on the pathological structure of lung tissue infected with FM1(H-E×100)

Fig 2 Effect of BAI on mRNA expressions of c-jun and c-fos in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

3 討論

研究表明，甲型流感病毒感染后的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo) NF-κB和AP-1活化，磷酸化 NF-κB和AP-1入核后調(diào)控下游多種生物學(xué)活性的致炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的表達(dá)［7-8］。如果病毒不能被及時(shí)清除，就會(huì)造成大量炎細(xì)胞的浸潤(rùn)而損傷正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而引起病毒性肺炎［9］。

AP-1是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于亮氨酸拉鏈蛋白家族，由 jun(c-jun、junB 和 junD)、fos(c-fos、fosB、fral和fra2)組成的同型或異型二聚體，jun蛋白可以形成同源二聚體，而fos蛋白只能與jun蛋白聚合成異源二聚體［10］。在正常狀態(tài)下，AP-1以同源二聚體為主且濃度和活性很低;當(dāng)機(jī)體受到病原體刺激時(shí)，AP-1蛋白短時(shí)間內(nèi)迅速升高，而且轉(zhuǎn)變?yōu)橐詂-fos與c-jun異二聚體為主的存在形式，該二聚體穩(wěn)定且具有與DNA結(jié)合的強(qiáng)大的親和力，能與某些基因啟動(dòng)子TAP反應(yīng)元件(TRE)或cAMP反應(yīng)原件(CRE)結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)［11］，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值、分化和轉(zhuǎn)化，參與體內(nèi)免疫系統(tǒng)的調(diào)控、細(xì)胞凋亡的發(fā)生以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)等［12-13］。由于c-jun亞基是構(gòu)成AP-1蛋白的結(jié)構(gòu)成分之一，所以通過(guò)測(cè)定c-jun亞基的表達(dá)量便可確定AP-1蛋白的表達(dá)量，而通過(guò)測(cè)定p-c-jun含量便可確定細(xì)胞核中有活性AP-1的含量。

Fig 3 Effect of BAI on protein expressions of c-jun and p-c-jun in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的肺組織病變很嚴(yán)重，c-jun、c-fos mRNA，c-jun、p-c-jun 蛋白，致炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β 分泌水平明顯升高;經(jīng) BAI 750、375 mg·kg-1治療后，肺組織病變明顯改善，肺組織細(xì)胞c-jun、c-fos mRNA以及c-jun、p-c-jun蛋白表達(dá)明顯下降，肺勻漿的致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β分泌水平降低。這表明BAI能通過(guò)抑制AP-1信號(hào)通路的激活來(lái)降低炎性細(xì)胞因子分泌，從而減輕病理?yè)p傷，對(duì)流感引起的肺炎有良好的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)1 500 mg·kg-1劑量的BAI作用效果不明顯，可能與高劑量BAI的類抗生素作用有關(guān)?？诜﨎AI后，其在腸道菌作用下先被水解為黃芩素，后者通過(guò)腸黏膜被吸收，再被轉(zhuǎn)化成BAI。因此，BAI的口服吸收受到腸道厭氧菌群水解作用的制約［14-15］。BAI 1 500 mg·kg-1可能因濃度高引起了菌群系統(tǒng)的失調(diào)，從而影響了BAI的吸收效率。BAI抗甲型流感病毒的最小有效劑量將需要進(jìn)一步研究確定，待后續(xù)報(bào)道。

［1］ 熊 英，傅穎媛，況南珍，等.黃芩苷抗白念珠菌作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(12):1404-7.

［1］ Xiong Y，F(xiàn)u Y Y，Kuang N Z，et al.Study on activity and mechanism of Baicalin against candida albicans［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(12):1404-7.

［2］ Aaby K，Hvattum E，Skrede G.Analysis of flavonoids and other phenolic compounds using high-performance liquid chromatography with coulometric array detection:relationship to antioxidant activity［J］.J Agric Food Chem，2004，52(15):4595-603.

［3］ 況南珍，傅穎媛，黃彬紅，等.黃芩苷對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC7721抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(6):1422-4.

［3］ Kuang N Z，F(xiàn)u Y Y，Huang B H，et al.An Experimental study on inhibitory effect of baicalin on human hepatic carcinoma celline SMMC7721 in vitro［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2008，19(6):1422-4.

［4］ 萬(wàn)巧鳳，顧立剛，殷勝駿，等.黃芩苷對(duì)FM1肺炎小鼠肺組織細(xì)胞凋亡FAS/FAS-L系統(tǒng)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(11):1555-9.

［4］ Wan Q F，Gu L G，Yin S J，et al.Effect of Baicalin on cell apoptosis FAS/FAS-L system of pneumonia mice lung tissue infected with FM1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1555-9.

［5］ 初正云，初 明，滕 宇.黃芩苷體內(nèi)抗流感病毒作用［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(22):2413-5.

［5］ Chu Z Y，Chu M，Teng Y.Effect of baicalin on in vivo anti-virus［J］.J Chin Mat Med，2007，32(22):2413-5.

［6］ 鄭金粟，顧立剛.痰熱清注射液對(duì)流感病毒FM1感染小鼠抗病毒作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(7):851-4.

［6］ Zheng J S，Gu L G.Study on anti-virus effect of Tan Re Qing injection on the mice with influenza virus FM1 infected［J］.China J Tradit Chin Med Pharmacy，2009，24(7):851-4.

［7］ Julkunen I，Sareneva T，Pirhonen J，et al.Molecular pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2001，12(2-3):171-80.

［8］ Kaufmann A，Salentin R，Meyer R G，et al.Defense against influenza A virus infection:essential role of the chemokine system［J］.Immunobiol，2001，204(5):603-13.

［9］ 張艷麗，范新生，李澎濤，等.毒熱平注射液抗流感病毒肺損傷機(jī)制的研究［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(1):33-5.

［9］ Zhang Y L，F(xiàn)an X S，Li P T，et al.Anti viral Mechanism of dureping injection on lung injury in mice［J］.J Ningxia Med Univ，2010，32(1):33-5.

［10］何慶南.轉(zhuǎn)錄因子AP-1的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，1999，26(3):152-5.

［10］ He Q N.Research progress of transcription factor AP-1［J］.Foreign Med Sci Paed，1999，26(3):152-5.

［11］ Chimenov Y，Kerppola T K.Close encounters of many kinds:Fos-Jun interactions that mediate transeription regulatory specificity［J］.Oncogene，2001，20(19):2438-52.

［12］ Liebermann D A，Gregory B，Hoffman B.AP-1(Fos/Jun)transcription factors in hematopoietic differentiation and apoptosis［J］.Int J Oncol，1998，12(3):685-700.

［13］ Shaulian E，Karin M.AP-1 as a regulator of cell life and death［J］.Nat Cell Biol，2002，4(5):131-6.

［14］劉太明，蔣學(xué)華.黃芩苷和黃芩素大鼠在體胃、腸的吸收動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006(12):999-1001.

［14］ Liu T M，Jiang X H.Studies on the absorption kinetics of baicalin and baicalein in rats’stomachs and intestines［J］.China J Chin Mater Med，2006(12):999-1001.

［15］羅海燕，宋姍姍，黃暨生，等.黃芩苷對(duì)小鼠腸道菌群影響的量-時(shí)規(guī)律觀察［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010(32):42-9.

［15］ Luo H Y，Song S S，Huang J S，et al.Observing of Baicalin on the rats intestinal flora［J］.Guide China Med，2010(32):42-9.