黃芩提取物中黃酮類成分血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定

馮志強(qiáng)，韓 堅(jiān)，謝智勇，廖瓊峰，張 蕾

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510080)

黃芩(Radix Scutellariae)為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，主要活性成分為黃酮類化合物［1］。臨床上藥理作用廣泛，在許多方劑中均有配伍使用，如《金匱要略》收載方劑248方，其中含黃芩有20余方［2］。血漿蛋白結(jié)合率是進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究的重要參數(shù)［3］，而關(guān)于黃芩黃酮類成分，目前僅有黃芩苷單體血漿蛋白結(jié)合率的報(bào)道文獻(xiàn)［4-5］，對(duì)于總黃酮部位中多種黃酮類成分血漿蛋白結(jié)合率的研究尚未見報(bào)道。本文以黃芩苷(namely baicalin，BL)、漢黃芩苷(wogonoside，WL)、漢黃芩素(wogonin，W)、千層紙素A(oroxylin A，OA)作為檢測(cè)指標(biāo)，采用平衡透析法研究其在大鼠血漿中的藥物蛋白結(jié)合率，為進(jìn)一步研究黃芩及其復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AnkeTDL-40B離心機(jī)(上海科學(xué)安瓶科學(xué)儀器制造廠);Precisa XS225A十萬分之一分析天平;天美T2000P高效液相色譜儀(UV detector，上海天美科學(xué)儀器有限公司);透析袋(14 000 D，廣州文睿科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芩總黃酮(水提酸沉;各指標(biāo)成分含量:黃芩苷50.05%，漢黃芩苷1.06%，漢黃芩素6.39%，千層紙素A 0.83%);黃芩苷、漢黃芩素(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110715-200212、1514-200202);漢黃芩苷(西安融升生物科技有限公司，批號(hào):091126，含量＞98%);千層紙素 A、高麗槐素(自制，含量＞98%);色譜甲醇、乙腈(Merk公司);其余試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，180～220 g，♀♂各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Synergi C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1% 甲酸水(B)，梯度洗脫:0～5 min(A:32% ～35%)，5～15 min(A:35% ～50%)，15 ～25 min，(A:50% ～50%);流速 1.0 ml·min-1;檢測(cè)波長:275 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

2.2 樣品處理

2.2.1 透析內(nèi)液 取空白血漿(或透析內(nèi)液)200 μl，加入混合系列對(duì)照品溶液(或甲醇)600 μl，內(nèi)標(biāo)(400 mg·L-1)100 μl，渦旋 3 min，12 000 r·min-1離心 5 min，取上清液。

2.2.2 透析外液 除不加內(nèi)標(biāo)外，其他同“2.2.1”項(xiàng)下操作。

2.3 方法學(xué)建立

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 通過比較大鼠空白血漿(或空白透析液)、空白血漿(或空白透析液)加對(duì)照品和給藥透析平衡后透析內(nèi)液(或透析外液)的色譜圖，來考察分析方法的專屬性，結(jié)果表明，血漿和透析外液中內(nèi)源性物質(zhì)及黃芩提取物中的其它組分與指標(biāo)化合物分離度良好，不干擾測(cè)定(Fig 1)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A對(duì)照品適量，用色譜甲醇配制成濃度分別為994、422、135和107 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。各精密吸取適量，分別配制兩組6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液(內(nèi)、外液)。取大鼠空白血漿和空白透析液各200 μl，按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，記錄色譜圖和峰面積。采用加權(quán)(1/χ2)最小二乘法，以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Ai/As)對(duì)質(zhì)量濃度(Ci)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程即為透析內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)曲線;以各成分峰面積(Ai)對(duì)質(zhì)量濃度(Ci)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程即為透析外液標(biāo)準(zhǔn)曲線(Tab 1)。

Fig 1 HPLC chromatograms of four major flavonoids in total flavonoids extract of scutellaria baicalensis Georgi inside and outside the dialysis membranes

Tab 1 Standard curves of four compounds in plasma

2.3.3 準(zhǔn)確度與精密度 按“2.3.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)濃度的模擬血漿樣品和模擬透析液樣品，按各樣品處理方法考察準(zhǔn)確度和精密度。模擬血漿樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，考察日內(nèi)和日間精密度(RSD)，準(zhǔn)確度以相對(duì)誤差(RE%)表示，見Tab 2。

2.3.4 提取回收率 用空白血漿配制成低、中、高3個(gè)濃度的模擬血漿樣品，每一濃度6樣本分析，照“2.2”項(xiàng)下方法操作，峰面積記為A;同時(shí)，另以水代替血漿同法制備，峰面積記為B。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值(A/B)計(jì)算提取回收率，3種濃度下各成分的提取回收率分別為BL(66.1±3.0)%、WL(90.8±6.4)%、W(95.4±7.8)%、OA(93.6±4.6)%。同法測(cè)定內(nèi)標(biāo)的提取回收率為(91.7±2.0)%。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 分別考察模擬血漿樣品和模擬透析外液樣品在-20℃凍藏14 d、預(yù)處理后室溫放置和4℃條件下放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:血漿樣品中，黃芩苷-20℃凍藏14 d、室溫放置6 h和4℃放置24 h均穩(wěn)定;平衡透析液中，黃芩苷室溫下不穩(wěn)定，但在4℃條件下可穩(wěn)定36 h。其余成分各條件下均穩(wěn)定。

Tab 2 Validation of the intra-day and inter-day assays

2.4 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定 將預(yù)處理過的透析袋(長度約10 cm)一端折疊，結(jié)扎，于另一端加入新鮮大鼠血漿2 ml，留一小段氣泡，后將其扎緊，懸浮于盛有20 ml含藥透析液(提取物濃度41.6、62.4和104 mg·L-1)的廣口瓶中，每濃度3樣本，置4°C的冰箱冷藏平衡(12 h)，精密移取內(nèi)、外液200 μl，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，分別測(cè)定透析袋內(nèi)血漿藥物濃度(總濃度Dt)和透析外液中藥物濃度(游離藥物濃度Df)，根據(jù)公式:血漿蛋白結(jié)合率=(Dt– Df)/Dt×100%計(jì)算各指標(biāo)成分的血漿蛋白結(jié)合率(Tab 3)。數(shù)據(jù)應(yīng)用F檢驗(yàn)驗(yàn)證其方差齊性后，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，黃芩苷和漢黃芩苷在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率存在質(zhì)量濃度依賴性(P＜0.01)，漢黃芩素和千層紙素A則不存在質(zhì)量濃度依賴性(P＞0.05)。

Tab 3 Protein binding rates of 4 compounds in plasma of rats(n=3)

3 討論

平衡透析法原理簡(jiǎn)單，操作方便，是經(jīng)典和常用的測(cè)定方法［6-7］，但由于平衡透析時(shí)間長，須考察藥物的穩(wěn)定性。因此，對(duì)黃芩苷穩(wěn)定性因素的考慮是方法建立的關(guān)鍵。本研究表明，黃芩苷在透析液中的降解速率，提取物給藥比單體給藥明顯降低，且呈現(xiàn)溫度依賴性，在4℃條件下可穩(wěn)定36 h。操作中為防止樣品在處理過程中降解，所有樣品均在冰浴上處理，低溫渦旋、離心、測(cè)定(4℃)，所用樣品管預(yù)先置于-20℃，試劑于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物中，黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A 4個(gè)成分與大鼠血漿有較高的結(jié)合率(＞80%)。其中，黃酮苷類成分(黃芩苷和漢黃芩苷)隨著藥物濃度的增加，蛋白結(jié)合率呈下降趨勢(shì)，推測(cè)其可能隨給藥劑量的不同有較大差異，而黃酮苷元(漢黃芩素和千層紙素A)則是非呈現(xiàn)濃度依賴性，提示黃酮苷和苷元由于結(jié)構(gòu)和極性不同，其蛋白結(jié)合率亦有較大差異。

藥物經(jīng)吸收進(jìn)入血液后部分呈游離的分子狀態(tài)，部分則與血漿蛋白質(zhì)可逆性結(jié)合，只有游離的藥物可以發(fā)揮藥效。當(dāng)游離的藥物從組織或血液中清除后，部分結(jié)合藥物可與血漿蛋白質(zhì)解離，從而彌補(bǔ)游離藥物。藥物與血漿蛋白質(zhì)的可逆性結(jié)合不僅影響其代謝動(dòng)力學(xué)、作用強(qiáng)度與作用時(shí)間，而且往往與藥物的作用機(jī)制、藥物相互作用等密切相關(guān)，因此，本研究可為含黃芩的復(fù)方及其組分(群)配伍研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］ 國家藥典委員會(huì).《中國藥典》Ⅰ部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:282-3.

［1］ Chinese PharmacopoeiaCommission.Chinese pharmacopoeia，Volume Ι［S］.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2010:282-3.

［2］ 王 娜.中藥黃芪、黃芩有效成分的體外抑菌作用研究［D］.燕山大學(xué)，2009.

［2］ Wang N.Experimental study on antimicrobial effects of active principle from Chinese traditional medicine astragalus membranaceus bge and scutellaria in vitro［D］.Yanshan Univ，2009.

［3］ 周 玲，居文政，劉子修，等.燈盞細(xì)辛注射液多成分血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):719-22.

［3］ Zhou L，Ju W Z，Liu Z X，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in Dengzhanxixin injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):719-22.

［4］ 王 弘，陳濟(jì)民，張清民.用高效液相色譜法測(cè)定人血漿中黃芩苷與血漿蛋白的結(jié)合率［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(9):107-9.

［4］ Wang H，Chen J M，Zhang Q M.High-performance liquid chromatographic determination of baicalin in human plasma［J］.J Shenyang Pharm Univ，2000，17(9):107-9.

［5］ 陳 瑩，李 月.超濾法測(cè)定黃芩苷的血漿蛋白結(jié)合率［J］.山西醫(yī)藥雜志，2010，39(7):677-8.

［5］ Chen Y，Li Y.Determination of plasma protein binding rate of baicalin by ultrafiltration［J］.Shanxi Med J，2010，39(7):677-8.

［6］ Hage D S，Tweed S A.Recent advances in chromatographic and electrophoretic methods for the study of drug-protein interactions［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1997，699(1-2):499-525.

［7］ Oravcová J，B?hs B，Lindner W.Drug-protein binding sites.New trends in analytical and experimental methodology［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1996，677(1):1-28.