PI3K/mTOR抑制劑BEZ235抑制HepG2細(xì)胞增殖及與阿霉素的協(xié)同效應(yīng)

張顯忠，郭愛軍，廉立慧，姜紅霞，史仁玖

(1.泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271016;2.泰安市中心醫(yī)院放射科，山東泰安 271000)

肝細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率較高，發(fā)生發(fā)展受細(xì)胞內(nèi)多條信號傳導(dǎo)通路的精密調(diào)控［1－2］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)信號通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［3－4］。BEZ235是磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)和其下游因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的雙重靶向抑制劑，表現(xiàn)出良好的抑制多種實(shí)體瘤活性［5－7］。本研究以肝癌細(xì)胞

HepG2為實(shí)驗(yàn)材料，檢測BEZ235的體外抗癌活性及與阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX，adriamycin，ADM)協(xié)同抑癌作用，為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 BEZ購自 Selleck Chemicals(Houston，TX，USA);RPMI 1640 培養(yǎng)基購自 Gibco(BRL，USA);胎牛血清購自 Lanzhou National Hy-Clone(Lan zhou，China);MTT購自 Genview(Houston，TX，USA);propidium iodine(PI)購自 Sigma;Annexin V-FITC購自南京凱基生物有限公司;ECL試劑盒購自 Thermo Scientific Pierce(Rockford，IL，USA)。Akt抗體、p-Akt抗體和 β-catenin抗體購自Cell Signaling;β-actin抗體購自Sigma;cyclinB1抗體和cyclinD1抗體購自Santa cruz;二抗均購自北京中杉金橋;DOX購自深圳萬樂藥業(yè)。

1.2 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自上海中科院細(xì)胞庫。HepG2細(xì)胞于37℃和5%CO2條件下用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，含有10%胎牛血清(蘭州民海)、100 U·L－1青霉素和 100 μg·L－1硫酸鏈霉素。

1.3 MTT法測定細(xì)胞活力 胰酶消化HepG2細(xì)胞后接種于96孔板中，加入不同劑量的BEZ235繼續(xù)培養(yǎng)，對照組加入PBS;終止培養(yǎng)前4 h加20 μl(5 g·L－1)的MTT于各個(gè)孔中，然后吸去培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO后室溫振蕩10 min;490 nm波長下測定各孔的A值，以同樣的方法測6個(gè)平行孔，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡 細(xì)胞用BEZ235處理后，胰酶消化并制備細(xì)胞懸液;加入75%的冷無水乙醇4℃固定18 h后用PBS洗2次，加入終濃度為50 mg·L－1的 RNase A，37℃ 30 min，加入終濃度為 50 mg·L－1的 PI，4℃閉光染色 20 min后上機(jī)檢測。用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞的周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例。同時(shí)按照試劑盒說明進(jìn)行 AnnexinⅤ-FITC/PI法測定細(xì)胞凋亡，根據(jù)AnnexinⅤ和PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡分析 預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次后加細(xì)胞裂解液(10 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.0，1 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，1%NP-40，1 mmol· L－1PMSF，0.5% SDS，protease inhibitor cock-tails)，冰上放置20 min，4℃ 13 000×g離心20 min，收集上清定量分析。取40 μg總蛋白進(jìn)行 SDSPAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入抗 Akt、p-Akt、β-actin、cyclinB1、cyclinD1、β-catenin、p-ERK 和 p-P38一抗;室溫孵育3 h后加入對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS軟件t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 BEZ235抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化

由于BEZ235是PI3K/Akt通路的抑制劑，因此本實(shí)驗(yàn)首先采用免疫印跡法檢測了BEZ235對HepG2細(xì)胞中PI3K下游底物Akt磷酸化水平的影響。如Fig 1所示，BEZ235降低了HepG2細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，且抑制作用呈劑量依賴性。

2.2 BEZ235抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖 用BEZ235處理HepG2細(xì)胞72 h，MTT法每隔24 h檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見Fig 2，BEZ235具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的活性，且呈時(shí)間和劑量依賴性。

流式細(xì)胞術(shù)檢測BEZ235對細(xì)胞周期的影響，如圖所示(Fig 3)，HepG2細(xì)胞經(jīng)BEZ235處理后，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G1期。但Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測BEZ235對HepG2細(xì)胞凋亡的影響。HepG2細(xì)胞經(jīng)BEZ235作用24 h后，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的凋亡無明顯變化(Fig 4)。

Fig 1 Akt phosphorylation in HepG2 cells inhibited by BEZ235

Fig 2 Effects of BEZ235 on HepG2 cell viability detected by MTT

Fig 3 Effects of BEZ235 on HepG2 cell cycle detected by flow cytometry

2.3 BEZ235調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) cyclinB1和 cyclinD1蛋白表達(dá)水平 為了闡明BEZ235阻滯細(xì)胞周期的可能機(jī)制，采用免疫印跡法分析了細(xì)胞內(nèi)cyclinB1和cyclinD1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)BEZ235對細(xì)胞周期的調(diào)控與cyclinD1相關(guān)，而對cyclinB1的表達(dá)無影響(Fig 5)。

Fig 4 Effects of BEZ235 on cell apoptosis detected by Annexin V/PI double staining

Fig 5 Effects of BEZ235 on expression level of cyclin B，and cyclinD，in HepG2 cells detected by western blot

2.4 BEZ235對 DOX抑癌活性的協(xié)同作用BEZ235與 DOX聯(lián)合應(yīng)用后，從抑制曲線上看，BEZ235明顯提高了DOX對HepG2細(xì)胞的抑制作用，根據(jù)CDI計(jì)算方法［8］，除了低劑量組外(BEZ235=0.5 μmol·L－1DOX=0.5 mg·L－1)，其他兩組聯(lián)合用藥的CDI均小于1，提示BEZ235聯(lián)合應(yīng)用DOX具有協(xié)同效應(yīng)。

Fig 6 Synergistic effects of BEZ235 combined with DOX on HepG2 cells

2.5 BEZ235與DOX的聯(lián)合應(yīng)用抑制細(xì)胞內(nèi)βcatenin表達(dá) 為了進(jìn)一步探討B(tài)EZ235與DOX協(xié)同抑癌效應(yīng)的分子機(jī)制，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測了HepG2細(xì)胞內(nèi)β-catenin和MAPK通路因子p-ERK、p-p38的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)BEZ235與DOX的聯(lián)合應(yīng)用明顯抑制細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)，ERK和p38的磷酸化水平未見明顯變化。

Fig 7 Inhibition of β-catenin expression in HepG2 cells by BEZ235 combined with Dox

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號通路不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝等生命過程，該途徑的過度活化還與腫瘤的耐藥性有著密切的聯(lián)系，可降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［9－11］。因此，研究PI3K/Akt/mTOR信號通路的特異性抑制劑對癌癥的臨床治療具有重要的意義。以PI3K的p110催化亞基為靶點(diǎn)的LY294002和wortmannin與化療藥物聯(lián)合使用能夠有效地增加化療藥物的作用并降低毒性［12］，表明PI3K抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)用為腫瘤患者的耐藥現(xiàn)象提供了更好的選擇。

本研究首先檢測PI3K/Akt抑制劑BEZ235對HepG2細(xì)胞中Akt磷酸化水平的影響，發(fā)現(xiàn)BEZ235具有抑制S473p-Akt的活性，同時(shí)抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。為了進(jìn)一步闡明BEZ235抑制肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，流式細(xì)胞術(shù)分析了BEZ235對細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞經(jīng)BEZ235處理后，細(xì)胞阻滯于G1期。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明BEZ235誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期的阻滯與抑制cyclinD1的表達(dá)密切相關(guān)。磷脂酰絲氨酸外翻分析法結(jié)果表明檢測BEZ235對HepG2細(xì)胞無明顯凋亡誘導(dǎo)活性，意味著BEZ235的抗腫瘤活性主要表現(xiàn)在其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

DOX是臨床上常用的蒽醌類化療藥物，本研究首次將BEZ235與DOX聯(lián)合應(yīng)用處理肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BEZ235能夠促進(jìn)DOX的抑癌活性，其機(jī)制涉及抑制β-catenin表達(dá)。β-catenin是由781個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，是Wnt通路的關(guān)鍵因子，可通過Wnt/Frizzled受體通路促進(jìn)原癌基因的激活，并誘導(dǎo)細(xì)胞癌變和腫瘤發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)BEZ235與DOX的聯(lián)合應(yīng)用抑制β-catenin的表達(dá)水平，提示BEZ235與DOX的協(xié)同作用可能與調(diào)控HepG2細(xì)胞內(nèi)的β-catenin通路相關(guān)。另外，β-catenin的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥性也相關(guān)。因而提示，BEZ235與DOX聯(lián)合，除產(chǎn)生協(xié)同相應(yīng)外，還可能防治腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥發(fā)生。

總之，BEZ235能夠抑制HepG2肝癌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，并抑制細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1的表達(dá)水平有關(guān);BEZ235和DOX的聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的生長抑制具有協(xié)同作用，其機(jī)制與抑制細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)相關(guān)。

［1］Villanueva A，Llovet J M.Targeted therapies for hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2011，140(5):1410－26.

［2］Rahbari N N，Mehrabi A，Mollberg N M，et al.Hepatocellular carcinoma:current management and perspectives for the future［J］.Ann Surg，2011，253(3):453－69.

［3］黃 成，李 俊，馬陶陶.PI3K/Akt信號通路與肝纖維化［J］.

中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(8):1037－41.

［3］Huang C，Li J，Ma T T.PI3K/Akt signaling pathway and liver fibrosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(8):1037－ 41.

［4］Li L，Wei X H，Pan Y P，et al.LAPTM4B:a novel cancer－ associated gene motivates multidrug resistance through efflux and activating PI3K/AKT signaling［J］.Oncogene，2010，29(43):5785－95.

［5］Herrera V A，Zeindl-Eberhart E，Jung A，et al.The dual PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 is effective in lung cancer cell lines［J］.Anticancer Res，2011，31(3):849－54.

［6］Santiskulvong C，Konecny G E，F(xiàn)ekete M，et al.Dual targeting of phosphoinositide 3-kinase and mammalian target of rapamycin using NVP-BEZ235 as a novel therapeutic approach in human ovarian carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2011，17(8):2373－84.

［7］Liu T J，Koul D，LaFortune T，et al.NVP-BEZ235，a novel dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor，elicits multifaceted antitumor activities in human gliomas［J］.Mol Cancer Ther，2009，8(8):2204－10.

［8］Wang D，Wang Z，Tian B，et al.Two hour exposure to sodium butyrate sensitizes bladder cancer to anticancer drugs［J］.Int J Urol，2008，5:435－41.

［9］Butt A J.Overcoming resistance:Targeting the PI3K/mTOR pathway in endocrine refractory breast cancer［J］.Cancer Biol Ther，2011，11(11):947－9.

［10］Li L，Wei X H，Pan Y P，et al.LAPTM4B:a novel cancer-associated gene motivates multidrug resistance through efflux and activating PI3K/AKT signaling［J］.Oncogene，2010，29(43):5785－95.

［11］熊 飛，詹 瑧，唐于平，等.PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在非小細(xì)胞肺癌中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(10):1264－7.

［11］Xiong F，Zhan Z，Tang Y P，et al.The effect of PI3K/Akt signal transduction pathway in non－ small cell lung cancer［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1264－7.

［12］Wu D，Tao J，Xu B，et al.Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 suppresses proliferation and sensitizes doxorubicin chemotherapy in bladder cancer cells［J］.Urol Int，2011，86(3):346－54.