陳冬蓮，侯華新，鄭 華，梁 燕，黎丹戎

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021)

越來(lái)越多的研究表明自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且腫瘤的放化療過(guò)程可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，如Peng等［1］在研究小檗堿對(duì)A549放射增敏作用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)放射增敏與細(xì)胞自噬能力之間有著緊密的聯(lián)系。本課題前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)廣西產(chǎn)何首烏中無(wú)細(xì)胞毒作用濃度5 mg·L－1大黃素聯(lián)合2Gy射線照射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1具有明顯的放射增敏作用，放射增敏比為 1.39［2］，為了研究大黃素在放射增敏過(guò)程中是否伴隨著自噬的發(fā)生及其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電鏡觀察大黃素在放射增敏過(guò)程鼻咽癌細(xì)胞CNE-1自噬體形成的超微結(jié)構(gòu)變化，real-time PCR定量檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，探討放射增敏與自噬發(fā)生的關(guān)系。

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源 人鼻咽癌高分化CNE-1細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑 大黃素由課題組前期從廣西何首烏分離獲得并經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，純度為99%。實(shí)驗(yàn)中加入無(wú)細(xì)胞毒作用濃度5 mg·L－1。TRIzol REAGENT(Invitrogen公司，美國(guó))、異丙醇和三氯甲烷為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭EPC處理水、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美國(guó))、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司出品)、滅菌注射用水、RPMI 1640(Gibco公司)

1.3 主要儀器 超低溫高速離心機(jī)5810 R(德國(guó)Eppendorf公司)、ABI 7300 Real-time PCR 儀、Nano Drop 2000(Thermo公司)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、倒置相差熒光顯微鏡Axiovert 200。采用60Co射線(加拿大Theratronics產(chǎn)品)為照射源，劑量率94.41 cGy·min－1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行相應(yīng)劑量的照射。

1.4 引物序列 根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2 核酸序列，設(shè)計(jì)特異PCR引物，以β-actin作為內(nèi)參照，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，其引物序列及產(chǎn)物大小見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences and product lengths

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于37℃ 體積百分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含體積百分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成4組，空白對(duì)照(A組):用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。大黃素(B組):給予無(wú)細(xì)胞毒終濃度為5 mg·L－1的大黃素，藥物作用24 h，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。照射(C組):給予60Co2Gy照射后，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。放射增敏(D組):終濃度為5 mg·L－1大黃素作用細(xì)胞24 h后給予60Co2Gy照射，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后，用PBS漂洗細(xì)胞表面3次，胰酶消化后將細(xì)胞離心成團(tuán)，加入預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%戊二醛，4℃過(guò)夜，送檢。

2.4 Real-time PCR法檢測(cè)ULK1、GABARAPL1、Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nano Drop 2 000定量測(cè)定濃度，1.9≤A260/A280≤2.1，10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。取2 μg總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)條件見Tab 2。

Tab 2 PCR amplification reaction conditions of target gene

參照文獻(xiàn)［3］的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)以下公式求出目的基因相對(duì)表達(dá)指數(shù) F=10△CT，T/AT△CT，R/AR

該公式中，△CT，T表示實(shí)驗(yàn)組減去空白對(duì)照組目的基因Ct值的差，△CT，R表示實(shí)驗(yàn)組減去空白對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值的差，AT表示目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，AR表示內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，F(xiàn)表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于空白對(duì)照組的表達(dá)量，將其作為定量結(jié)果并用于分析。

3 結(jié)果

3.1 鼻咽癌各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 在透射電鏡下，與空白對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組均觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中空泡增多，線粒體腫脹變性，在這些變性的細(xì)胞器周圍出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)，有的被雙層膜環(huán)繞，形成典型的自噬體和自噬溶酶體的自噬現(xiàn)象，以大黃素組和放射增敏組尤為明顯，結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 Autophagosomes found under TEM(n=3)

3.2 鼻咽癌各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)情況ULK1、Beclin1、GABARAPL1、Bcl-2 基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線基本擬合良好，各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)0.99以上和擴(kuò)增效率90% 以上，說(shuō)明 PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定，結(jié)果可靠。各實(shí)驗(yàn)組基因mRNA表達(dá)情況結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 ULK1，GABARAPL1，Beclin1，Bcl-2 mRNA expression in different groups of CNE-1 cells(n=3)

與空白組比較，各組ULK1mRNA表達(dá)均升高(P＜0.05)，其中大黃素增敏組表達(dá)最高(P＜0.01);而Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GABARAPL1除大黃素增敏組明顯升高外(P＜0.05)，其它各組變化不明顯(P＞0.05)。

4 討論

細(xì)胞自噬是生物有機(jī)體適應(yīng)不同環(huán)境的有效的內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制，它的發(fā)生發(fā)展主要分為4個(gè)階段［4］:①細(xì)胞受到誘導(dǎo)，在胞質(zhì)內(nèi)形成小而扁平的由雙層膜構(gòu)成的自噬泡;②自噬泡延伸，包裹受損的細(xì)胞器和變性蛋白及核酸等，形成密閉的球狀自噬體;③自噬體可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡等;④形成自噬溶酶體。自噬過(guò)程中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)及其形態(tài)，可以通過(guò)透射電鏡觀察到。本研究的電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)除空白對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)了自噬泡或自噬體，特別是大黃素放射增敏組出現(xiàn)大量的自噬體及自噬溶酶體。可以推測(cè)，大黃素放射增敏作用可能與大黃素屬于生物還原性物質(zhì)，易于穿透細(xì)胞膜，聚集于胞質(zhì)內(nèi)，產(chǎn)生活性氧，引起細(xì)胞線粒體等細(xì)胞器的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度自噬有關(guān)。

細(xì)胞自噬往往是一把雙刃劍，它可使細(xì)胞器自我更新，維持細(xì)胞自身代謝從而抵抗外部環(huán)境的影響，而自噬的過(guò)度激活又可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器受損，發(fā)生自噬性死亡。自噬的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多條途徑的復(fù)雜的程序化過(guò)程，一系列自噬相關(guān)基因有序的參與其中。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)上游自噬信號(hào)被激活后，ULK1發(fā)生去磷酸化，與多種自噬相關(guān)基因形成啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵復(fù)合物，促進(jìn)下游自噬信號(hào)激活［5－6］。GABARAPL1 主要結(jié)合于自噬體或溶酶體膜上，該基因的上調(diào)可使形成的獨(dú)特膜性結(jié)構(gòu)(phagophore)不斷延伸，直至完全包裹待降解的細(xì)胞質(zhì)組分 ，由此形成自噬體。當(dāng)自噬體和溶酶體融合后，GABARAPL1表達(dá)量下降［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照細(xì)胞比較，低劑量射線、無(wú)細(xì)胞毒劑量大黃素與細(xì)胞作用后，細(xì)胞通過(guò)自噬，產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)，促使細(xì)胞對(duì)抗環(huán)境的變化，保持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)而免受損傷。而放射增敏組的ULK1急劇升高，GABARAPL1 mRNA呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，可能此時(shí)過(guò)多的細(xì)胞器或者蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬小泡而被降解，細(xì)胞的功能嚴(yán)重受損，出現(xiàn)不可逆的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入自噬性死亡階段。

有文獻(xiàn)研究表明，自噬與凋亡在某些情況下受控于同一刺激物并產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)，兩者的相互作用取決于受試物和細(xì)胞所處的環(huán)境［8］。Beclin1基因是細(xì)胞自噬過(guò)程中重要的正調(diào)節(jié)因子。它主要通過(guò)與PI3K3C形成復(fù)合體來(lái)調(diào)節(jié)其它的自噬相關(guān)蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位［9］。已有文獻(xiàn)證實(shí)通過(guò)上調(diào)Beclin1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生。Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡的重要蛋白之一，定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和連續(xù)的核膜上，Bcl-2 mRNA表達(dá)下降自噬增加。此外Beclinl可以通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2的相互作用并抑制自噬體形成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時(shí)，Beclin1與Bcl-2相互結(jié)合，抑制細(xì)胞自噬，當(dāng)內(nèi)環(huán)境被打破后，二者分離，Beclin1依賴的自噬增加［10］，可見 Beclin1與 Bcl-2表達(dá)與自噬和凋亡活性密切相關(guān)。本研究顯示，在不同的條件下，各組細(xì)胞Beclin1、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況出現(xiàn)下降。這可能是由于細(xì)胞受到藥物或射線等刺激后，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境被破壞，Beclin1與Bcl-2結(jié)合程度不同，部分細(xì)胞進(jìn)入了凋亡程序性死亡通道。究竟大黃素在放射增敏過(guò)程中如何實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬性死亡和凋亡程序性死亡的調(diào)控，有待進(jìn)一步深入研究。

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