AGEs通過RAGE促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α①

游 捷 朱明理 彭 偉 彭雪峰 劉曉紅 劉禮斌

(福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床學(xué)院，福建省內(nèi)分泌研究所，福州350001)

晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)與晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合導(dǎo)致機體的病理改變在糖尿病加速動脈粥樣硬化進(jìn)程中起重要作用。動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，近年有關(guān)T淋巴細(xì)胞功能紊亂與動脈粥樣硬化的關(guān)系引起人們的重視。氧化低密度脂蛋白、熱休克蛋白等可引起T淋巴細(xì)胞活化而啟動免疫反應(yīng)，在動脈粥樣硬化發(fā)病中起重要作用［1，2］。研究表明AGEs和氧化低密度脂蛋白一樣能刺激樹突狀細(xì)胞成熟，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子［3，4］。但目前AGEs對T淋巴細(xì)胞功能影響的研究還較少。本研究觀察AGEs對Jurkat細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)表面RAGE表達(dá)及分泌炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Jurkat細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫;RPMI1640培養(yǎng)粉購自Gibco公司;牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司;PHA購自Amresco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、RIPA 裂解液、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ECL)及蛋白濃度測定試劑盒(BCA)購自海門碧云天生物公司;人TNF-αELISA試劑盒購自武漢博士德公司;鼠抗人RAGE單克隆抗體，鼠抗人非特異IgG抗體購自Santa Cruz公司;兔抗人pp38MAPK、p38及pJNK、JNK多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司;兔抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 AGEs制備及細(xì)胞培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)［5］方法制備AGEs，常規(guī)進(jìn)行熒光測定，內(nèi)毒素測定。Jurkat細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 Jurkat細(xì)胞以1×105ml-1接種于96孔板，0.25μg/ml PHA預(yù)刺激24小時。予不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24小時，加 MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后離心去上清，加二甲亞砜100μl，振蕩10分鐘，酶標(biāo)儀上以波長490 nm測吸光度。

1.2.3 免疫印跡檢測 RAGE的表達(dá) Jurkat細(xì)胞以1×105ml-1接種于6孔板，PHA預(yù)刺激24小時。以不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24小時后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配平各組蛋白，10%SDS-PAGE，鼠抗人RAGE單抗(1∶500)及兔抗人β-actin單抗(1∶1 000)孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗(1∶1 500)室溫1小時，ECL試劑盒處理，暗室曝光。以Image J軟件分析各組灰度值，結(jié)果以目標(biāo)蛋白除β-actin表示。

1.2.4 ELISA 檢測 TNF-α 的表達(dá) Jurkat細(xì)胞以1×105ml-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PHA預(yù)刺激24小時。以不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200μg/ml)作用24小時后收集培養(yǎng)液上清，-80℃保存。同時裂解細(xì)胞測總蛋白，平衡各組細(xì)胞數(shù)。按照ELISA說明書操作檢測上清中TNF-α的濃度，結(jié)果以pg/mg表示。

1.2.5 免疫印跡檢測pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK Jurkat細(xì)胞以1×105ml-1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PHA預(yù)刺激24小時。以200μg/ml AGEs作用0、10、20、30、40 分鐘，然后收集細(xì)胞，提取總蛋白。Western blot檢測p38MAPK、JNK磷酸化，一抗兔抗人 pp38MAPK，p38MAPK、pJNK ，JNK均為1∶1 000稀釋，鼠抗兔二抗為1∶2 000稀釋，結(jié)果以pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK表示。

1.2.6 阻斷 RAGE、p38MAPK、JNK 對 TNF-α 的影響 為觀察RAGE在AGEs促進(jìn)TNF-α表達(dá)中的作用，用抗RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理Jurkat細(xì)胞1小時，以200μg/ml的AGEs作用24小時后收集培養(yǎng)液上清，-80℃保存。同時設(shè)非特異抗體組為對照。另一部分實驗200μg/ml AGEs作用前分別加入p38 MAPK、JNK阻滯劑SB203580(100μmol/L)、SP600125(30μmol/L)預(yù)孵育30分鐘。按照ELISA說明書操作檢測上清中TNF-α的濃度，結(jié)果以x±s，pg/mg表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果以x±s表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗，正態(tài)性檢驗，樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗和方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AGEs對Jurkat細(xì)胞存活率的影響 PHA具有刺激淋巴細(xì)胞活化分裂的作用，為模擬T細(xì)胞活化的雙信號機制，本實驗選用低濃度(0.25μg/ml)PHA提供協(xié)同刺激信號。不同濃度的AGEs或BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24 小時，測定各組細(xì)胞的吸光度，結(jié)果顯示AGEs和BSA對PHA預(yù)刺激后的Jurkat細(xì)胞的生長無明顯影響(P＞0.05)。

2.2 AGEs對Jurkat細(xì)胞RAGE表達(dá)的影響 為觀察AGEs對Jurkat細(xì)胞表面RAGE表達(dá)的影響，我們應(yīng)用Western blot檢測AGEs作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24小時后RAGE蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示PHA預(yù)刺激的 Jurkat細(xì)胞表達(dá)RAGE，50～200 μg/ml AGEs明顯上調(diào)RAGE表達(dá)，有濃度依賴關(guān)系(P﹤0.05～0.01)。不同濃度的BSA對RAGE蛋白的表達(dá)無明顯影響，見圖1。

2.3 AGEs對 Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α 的影響 不同濃度AGEs或BSA作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24小時后，ELISA檢測TNF-α分泌。結(jié)果顯示50μg/ml AGEs不影響PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞分泌 TNF-α，而 100～200 μg/ml AGEs能促進(jìn) Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α，與BSA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05 ～0.01)，見圖2。

2.3 AGEs對Jurkat細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響 200 μg/ml AGEs與PHA預(yù)處理后的Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)0～40分鐘后提取總蛋白，Western blot方法檢測p38MAPK、JNK磷酸化與非磷酸化水平的變化。結(jié)果表明AGEs作用Jurkat細(xì)胞10分鐘就能引起磷酸化p38MAPK表達(dá)增高，持續(xù)30～40分鐘，40分鐘后p38MAPK磷酸化有所下降，但仍較未刺激前明顯增高。AGEs作用 Jurkat細(xì)胞10分鐘后JNK磷酸化水平表達(dá)增高，30～40分鐘后JNK磷酸化水平達(dá)高峰。在AGEs作用40分鐘內(nèi)非磷酸化 p38MAPK、JNK水平無明顯改變(P＜0.01，見圖3)。

2.4 阻斷 RAGE、p38MAPK、JNK 對 TNF-α的影響 為觀察RAGE及其胞內(nèi)信號分子在AGEs促進(jìn)TNF-α表達(dá)中的作用，用抗RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理Jurkat細(xì)胞，再加200μg/ml AGEs刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示抗RAGE抗體抑制AGEs刺激的TNF-α的分泌，而非特異抗體對AGEs刺激的TNF-α的分泌無影響。應(yīng)用p38MAPK、JNK抑制劑能明顯抑制AGEs刺激的 TNF-α 的分泌(P ＜0.01，圖4)。

圖1 Western blot檢測AGEs對Jurkat細(xì)胞RAGE表達(dá)的影響Fig.1 Effect of AGEs on the expression of RAGE detected by Western blot

圖2 ELISA檢測AGEs對Jurkat細(xì)胞TNF-α分泌的影響Fig.2 Effects of AGEs on the secretion of TNF-α detected by ELISA

圖3 Western blot方法檢測AGEs對p38MAPK及JNK磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of AGEs on p38MAPK and JNK phosphorylation detected by Western blot

圖4 抗RAGE抗體、p38 MAPK、JNK抑制劑對AGEs誘導(dǎo)TNF-α分泌的影響Fig.4 Effects of anti-RAGE，inhibitors of p38MAPK ，JNK on the secretion of TNF-αinduced by AGEs

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)RAGE優(yōu)先表達(dá)于小鼠CD44+預(yù)激活的記憶池中的初始CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，而CD44-細(xì)胞表達(dá)較少［6］。我們的研究證實了人CD4+T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞表達(dá)RAGE，隨著AGEs誘導(dǎo)的濃度遞增，RAGE蛋白表達(dá)明顯增加。這種配體-受體正反饋調(diào)節(jié)的現(xiàn)象在多種細(xì)胞上有相似的表現(xiàn)，如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等。其原因一方面與核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-кB激活有關(guān)，AGEs可活化多種細(xì)胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄，而NF-κB對RAGE基因啟動子存在正向調(diào)控作用從而可增加RAGE在細(xì)胞表面的表達(dá)［7］。另一方面，研究認(rèn)為RAGE是一種類似于Toll樣受體(TLRs)的模式識別受體，內(nèi)毒素、活性氧、TNF-α等能直接促進(jìn)RAGE的表達(dá)［8］。RAGE和AGEs的其他受體不同，RAGE的作用并非清除體內(nèi)的AGEs，而是作為傳導(dǎo)AGEs信號的受體分子，介導(dǎo)了細(xì)胞對AGEs的大部分應(yīng)答反應(yīng)。這個特征使RAGE誘發(fā)了一種擴大的炎癥免疫作用，引起細(xì)胞的持續(xù)活化，在炎癥免疫性疾病中起重要作用。

我們進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)AGEs使PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α增加，RAGE抗體干預(yù)明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的TNF-α的分泌。這個結(jié)果說明AGEs對 Jurkat細(xì)胞分泌 TNF-α的影響是通過RAGE介導(dǎo)。研究表明RAGE在T細(xì)胞正常免疫過程中起重要作用，Dumitriu等［9］用內(nèi)源性高遷移率蛋白-1刺激抗-CD3和/或抗-CD28抗體預(yù)刺激的大鼠脾臟T細(xì)胞，可使T細(xì)胞大量增殖，表達(dá)更多的IFN-γ和IL-12，而抗RAGE抗體可使T細(xì)胞增殖和分化能力明顯降低。Moser等［6］把 RAGE+/+或RAGE-/-源的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)入同種異體RAGE-/-或RAGE+/+C57BL/6小鼠體內(nèi)，給小鼠腹腔內(nèi)注射雞卵清蛋白，發(fā)現(xiàn) RAGE+/+源 CD4+T細(xì)胞與RAGE+/+宿主都有利于T細(xì)胞的激活與增殖，并且使Th1型細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ明顯增多。Imani等［10］發(fā)現(xiàn)AGEs引起刀豆蛋白預(yù)刺激人外周血淋巴細(xì)胞粘附增加，并通過細(xì)胞表面65 kD的蛋白，促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)更多的IFN-γ。但他們的研究未明確該細(xì)胞表面蛋白的性質(zhì)。我們的研究提示AGEs通過RAGE并促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α增多，可能與糖尿病促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成有關(guān)。

還有一個引起我們興趣的發(fā)現(xiàn)是，抗RAGE抗體干預(yù)顯著抑制AGEs誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α，提示抑制RAGE的作用可抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能。其實已有多項研究提示抑制RAGE的作用起到免疫抑制的效果，Dunn等［11］給 IL-10陰性小鼠(慢性結(jié)腸炎齲齒類模型)腹腔注射sRAGE(RAGE可溶性片段，可結(jié)合RAGE的配體，起抑制RAGE的作用)，6周后發(fā)現(xiàn)sRAGE能明顯減少小鼠結(jié)腸黏膜下層出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，小鼠慢性結(jié)腸炎明顯減輕。Yan等［12］發(fā)現(xiàn)自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的脊髓高表達(dá)RAGE及其配體S100，給小鼠腹腔注射sRAGE或抗RAGE抗體，能明顯減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞的入侵;對小鼠發(fā)病癥狀進(jìn)行臨床評分，顯示阻斷RAGE使自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的病情明顯減輕。新近研究發(fā)現(xiàn)RAGE還參與移植排斥免疫，阻斷RAGE能明顯推遲心臟移植后急性免疫排斥反應(yīng)［13］。這些研究結(jié)果提示抑制RAGE的作用可能與免疫抑制有關(guān)，已有動物實驗應(yīng)用sRAGE或抗RAGE抗體可減少ApoE-/-小鼠動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，但是否與RAGE的免疫抑制作用有關(guān)，值得進(jìn)一步研究［14］。

細(xì)胞因子和絲裂原等均可激活應(yīng)激調(diào)節(jié)的蛋白激酶級聯(lián)，通過激酶活化基序的磷酸化而活化p38 MAPK和JNK，進(jìn)而激活NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、炎癥因子等多種基因的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)。Yeh等［15］發(fā)現(xiàn) AGEs和 RAGE結(jié)合引起p38 MAPK磷酸化進(jìn)而活化NF-κB促進(jìn)人單核細(xì)胞(THP-1)表達(dá)炎癥因子 TNF-α、IL-1、單核細(xì)胞趨化因子-1，與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。Sun 等［16］發(fā)現(xiàn) AGEs可通過 RAGE/p38MAPK/NF-κB途徑引起人內(nèi)皮祖細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)動脈硬化的形成。研究還發(fā)現(xiàn)AGEs通過JNK途徑使樹突狀細(xì)胞表面受體RAGE及CD83、CD86、MHCⅡ分子等表達(dá)增多，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，進(jìn)一步提高T淋巴細(xì)胞增殖能力、表達(dá)更多的炎癥因子IFN-γ、IL-12等，與動脈粥樣硬化的形成有關(guān)［3］。本實驗發(fā)現(xiàn)AGEs可引起p38MAPK、JNK磷酸化水平明顯增高，表明p38MAPK，JNK途徑已被激活;與 Yeh、Sun的研究一致。推測AGEs與其特異性受體RAGE結(jié)合，通過p38MAPK、JNK途徑促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌炎癥因子，在糖尿病血管病變中起作用。

動物實驗研究證實sRAGE及抗RAGE抗體能阻斷RAGE與配體反應(yīng)，并在多種炎癥免疫性疾病中起保護(hù)作用，但僅局限于細(xì)胞和動物實驗，尚未應(yīng)用于臨床治療。進(jìn)一步明確RAGE在炎癥免疫性疾病中的作用及其機制，尋找抑制RAGE的措施不但能減少糖尿病并發(fā)癥帶來的巨大危害，而且對其它與RAGE有關(guān)的慢性腎臟疾病、腫瘤、阿爾茨海默病等疾病防治也有好處。

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