慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾沉默Slug基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

錢 江 陳旺盛 文坤明 傅仲學(xué) (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，重慶400016)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)排第三位的惡性腫瘤，其死亡率占第四位［1］。目前雖然手術(shù)，放化療等傳統(tǒng)治療方式取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展，但仍有大量惡性腫瘤患者死于腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此，尋找一種嶄新的有效的治療方法和途徑，提高患者生存質(zhì)量有著重要的意義。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug作為E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在許多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。Yang等［2］研究發(fā)現(xiàn)Slug基因在惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建Slug基因shRNA慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，觀察其在體外對(duì)細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞凋亡周期的影響，為結(jié)直腸癌基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所;慢病毒載體系統(tǒng)pGCSILGFP Vector、pHelper1.0、pHelper2.0、大腸埃希菌菌株DH5、polybrene購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;Taq DNA聚合酶、Pyrobest?DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學(xué)發(fā)光(Electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;膜連蛋白 V-異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司;RPMI1640和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;胎牛血清為PAA原裝進(jìn)口;胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司;LipofectaminTM2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司;BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;GAPDH、GFP抗體和HRP標(biāo)記的鼠二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司;SYBR Real-time PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;Slug抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至50% ～70%融合度時(shí)，參考Translipid說(shuō)明書(shū)，用脂質(zhì)體Translipid分別轉(zhuǎn)染各種siRNA(50 nmol/L)。實(shí)驗(yàn)分組為:空白對(duì)照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA干擾組。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)Slug基因mRNA的表達(dá) 細(xì)胞分為空白對(duì)照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA三組。Trizol抽提細(xì)胞RNA，采用Oligo(dT)引物和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以各組細(xì)胞cDNA作為模板，每個(gè)組設(shè)立三個(gè)復(fù)孔進(jìn)行Real-time定量PCR檢測(cè)。GAPDH上游引物為:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物為:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';Slug基因上游引物為:5'-CAAGGACACATTAGAACTCACAC-3'，下游引物為:5'-CTACACAGCAGCCAGATTC-3'。PCR的反應(yīng)條件:95℃ 2分鐘;95℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒 (40個(gè)循環(huán))，反應(yīng)完成后，得出Ct值，然后計(jì)算出相應(yīng)Ct值，分析各組之間Slug基因的mRNA表達(dá)水平的差異。

1.2.3 Western blot法檢測(cè) HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞中Slug的表達(dá) 細(xì)胞分為空白對(duì)照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA三組。收集轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞濃度為1×107cells/ml，加入裂解液進(jìn)行蛋白的抽提，BCA法行蛋白的定量。每個(gè)樣品抽取20μg進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉一抗 (1∶100)稀釋后，4℃過(guò)夜孵育(內(nèi)參GAPDH抗體)，洗膜后用二抗(1∶500)在室溫下雜交1小時(shí)，洗膜，ECL發(fā)光，顯影定影。

1.2.4 MTT法測(cè)定HCT116細(xì)胞增殖活性 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備濃度為5×104cells/ml單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種100μl，基因沉默方法同前，測(cè)定轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 和 7 天細(xì)胞增殖活性。在距離時(shí)間點(diǎn)結(jié)束4小時(shí)時(shí)小心吸去上清，加入80μl無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，混勻后以酶標(biāo)儀490nm處讀取各孔吸光度值(A490)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=［1-(實(shí)驗(yàn)組A490均值/對(duì)照組A490均值)］×100%，以時(shí)間為橫坐標(biāo)軸，吸光度值為縱坐標(biāo)軸進(jìn)行繪圖。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 胰酶消化慢病毒轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使細(xì)胞完全分散變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS液洗滌3次，1 500 r/min離心10分鐘后收集細(xì)胞，棄上清，加入1 ml預(yù)冷PBS液重懸細(xì)胞，加入 PI(1∶100)及 RNase(1∶100)避光冰浴10分鐘，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，具體操作按照流式細(xì)胞周期分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各項(xiàng)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用方差檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA慢病毒感染HCT116細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率 慢病毒(Slug-pGC-GFP)當(dāng)MOI值為1時(shí)，感染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，于感染至3天后在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表明shRNA慢病毒已穩(wěn)定感染，其感染效率約為90%(圖1)。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)Slug基因的表達(dá) 病毒感染HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞后，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)可見(jiàn)轉(zhuǎn)染組Slug基因表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中Slug基因的表達(dá)水平，有明顯的抑制作用(P ＜0.05，圖2)。

2.3 Western blot檢測(cè)Slug基因在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá) pGCSIL-GFP-shSlug慢病毒對(duì)Slug蛋白表達(dá)的變化，與空載體組對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染組Slug蛋白的表達(dá)量顯著降低。見(jiàn)圖3。

2.4 MTT法檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖 HCT116細(xì)胞增殖能力在轉(zhuǎn)染pGCSIL-GFP-shSlug沉默Slug基因后明顯降低，且干擾組細(xì)胞增殖生長(zhǎng)速度較另外兩組細(xì)胞緩慢，在第4、5、6和7天，顯著差異(n=3，P＜0.05)，而陰性對(duì)照組與空白組間吸光度值無(wú)顯著差異(n=3，P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pGCSIL-GFP-shSlug慢病毒載體后，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用(圖4)。

圖1 HCT116細(xì)胞于慢病毒感染后在熒光顯微鏡下發(fā)出的綠色熒光(×100)Fig.1 HCT116 cells emitted green fluorescence under the fluorescence microscope after virus infection(×100)

圖2 Slug基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Slug mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of Slug mRNA in HCT116 cells after Slug gene RNAi

圖3 Slug基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Slug蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of Slug protein in HCT116 cells after Slug gene RNAi

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 HCT116細(xì)胞周期在Slug基因沉默后發(fā)生變化，Slug干擾組G0/G1期細(xì)胞百分比(52.3 ±0.6)與對(duì)照組(45.1 ±0.3)相比，明顯增加(P＜0.05)，S期細(xì)胞百分比(16.6±0.5)和對(duì)照組(23.2 ±0.6)比較，有所減少，G2/M期細(xì)胞百分比(27.1±0.4)低于對(duì)照組(32.6±0.7)。上述結(jié)果表明:沉默Slug基因能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞分裂明顯減緩(表1、圖5)。

表1 三組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期各期百分率比較Tab.1 Comparison of the percentages of HCT116 cells at different phases of cell cycle between three groups

圖4 MTT法檢測(cè)Slug基因抑制后HCT116細(xì)胞增殖Fig.4 The proliferation of HCT116 cells after Slug silence detected with MTT

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期Fig.5 The cell detected with flow cytometry

3 討論

RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)能抑制腫瘤細(xì)胞中某些癌基因的表達(dá)，同時(shí)也能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。在構(gòu)建慢病毒RNAi表達(dá)載體過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄發(fā)卡樣RNA主要是由慢病毒載體骨架和shRNA表達(dá)框構(gòu)成。慢病毒感染宿主細(xì)胞后，使shRNA表達(dá)框在細(xì)胞內(nèi)被RNA酶整合、轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)合成RNA干擾，培養(yǎng)持續(xù)表達(dá)shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株，就可以執(zhí)行RNA干擾作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)參與了胚胎發(fā)育和正常生理作用，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并且還與腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。EMT最重要的標(biāo)志性變化指標(biāo)為上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)的減少或丟失，而E-鈣粘蛋白作為細(xì)胞間重要的粘附分子，具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用［4］，Thiery 等［5］在對(duì)E-鈣粘蛋白表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞信號(hào)通路的研究中發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)E-鈣粘蛋白的調(diào)節(jié)為EMT的中心環(huán)節(jié)。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug作為Snail基因超家族中的一員，最早發(fā)現(xiàn)于原腸形成和神經(jīng)脊形成過(guò)程中的中胚層細(xì)胞。在EMT過(guò)程中是一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Slug基因作為E-cadherin的一個(gè)強(qiáng)有力的抑制因子，參與并調(diào)控胚胎發(fā)育、創(chuàng)口愈合、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、組織纖維化等生物學(xué)過(guò)程。Slug基因有高度保守的C2H2-型鋅指結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)與E-box結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，Slug基因作為Snail家族成員之一，能下調(diào)E-鈣粘蛋白，從而誘導(dǎo)發(fā)生EMT［6，7］。許多實(shí)驗(yàn)研究表明，Slug 基因過(guò)度表達(dá)在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用［8-11］。為了證實(shí)Slug基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中增殖能力和細(xì)胞凋亡周期中的作用，本研究在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)Slug基因的表達(dá)，shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中Slug mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少，本實(shí)驗(yàn)表明，干擾Slug基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)后可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。Slug基因沉默后，HCT116細(xì)胞在G0/G1期出現(xiàn)阻滯，提示沉默Slug基因后可以抑制細(xì)胞分裂，Slug基因可能是引起細(xì)胞周期改變，從而在結(jié)腸癌的惡性增殖中起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)了采用RNA干擾技術(shù)可有效地下調(diào)與惡性腫瘤密切相關(guān)基因的表達(dá)，初步探討了以Slug基因?yàn)榘悬c(diǎn)在結(jié)直腸癌基因治療方面的可行性，并為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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