Th17細(xì)胞在Graves’病中的變化及意義①

張玉娜 周喜娜 安 杰 朱鐵年 趙瑞景 (河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，石家莊050017)

Graves’病(Graves’disease，GD)是一種以甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺?gòu)浡栽龃鬄樘卣?，并?dǎo)致全身多系統(tǒng)高代謝表現(xiàn)的器官特異性自身免疫性疾?。?］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，其在普通人群中患病率約為1%，并有逐年增加的趨勢(shì)，女性多見(jiàn)。雖然公認(rèn)其發(fā)生與自身免疫有關(guān)，但迄今為止GD確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。本研究通過(guò)測(cè)定GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)接受抗CD3和抗 CD28抗體刺激后其中CD4+IL-17+T(Th17)細(xì)胞的數(shù)量、培養(yǎng)上清中IL-17 的水平、PBMC 中ROR-γt、IFN-γ 和IL-4 mRNA 的表達(dá)，以及甲狀腺組織中IL-17+細(xì)胞的分布情況，旨在探討Th17細(xì)胞在中國(guó)人GD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 來(lái)自于2010年4月至2011年3月在白求恩國(guó)際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科門(mén)診新確診未經(jīng)任何治療的GD患者30例。其中男8例，女22例，年齡22～45歲，平均33.6歲，病程1周～5年;免疫組化標(biāo)本來(lái)自具有手術(shù)指征的6例GD患者手術(shù)切除的甲狀腺組織和3例創(chuàng)傷死亡的正常甲狀腺組織。Graves’病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》(中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)，2008年)。排除其他原因引起的甲狀腺功能亢進(jìn)及其他自身免疫性疾病。30例健康對(duì)照者均來(lái)自白求恩國(guó)際和平醫(yī)院健康體檢的無(wú)血緣關(guān)系、無(wú)甲狀腺疾病家族史的人群，其中男10例，女20例，年齡25～50歲，平均36.1歲。疾病組和對(duì)照組在性別、年齡分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。全部研究對(duì)象均簽定知情同意書(shū)。該研究已經(jīng)過(guò)白求恩國(guó)際和平醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;抗人CD4-FITC購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司;抗人CD3及CD28抗體、抗人IL-17-PE單克隆抗體、人 IL-17 ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司;兔抗人 IL-17單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;二步法免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能檢測(cè) 空腹采集2 ml靜脈血，室溫靜置1小時(shí)后，1 000 r/min離心5分鐘，留取血清。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清中促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺激素(FT4)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)和甲狀腺過(guò)氧化酶抗體(TPOAb)的水平。

1.2.2 外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 空腹采集肝素抗凝外周靜脈血5 ml，迅速分離PBMC，加入抗人CD3 mAb、抗人CD28 mAb(終濃度均為1μg/ml)后放入5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，取2×105個(gè)PBMC加入抗人CD4-FITC，室溫避光孵育20分鐘后，破膜后加入IL-17-PE抗體，再次室溫避光孵育20分鐘后，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用500μl PBS緩沖液重懸混勻，上流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 ELISA檢測(cè)PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平 室溫平衡反應(yīng)試劑30分鐘后，每孔加入100μl樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入IL-17標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瑯悠房字屑尤?00μl培養(yǎng)上清，室溫避光孵育1小時(shí)后，每孔加入50μl Biotin-抗IL-17抗體，室溫避光孵育2小時(shí)，洗滌3次，所有孔中均加入Streptavidin-HRP，18～25℃室溫避光孵育1小時(shí)，棄上清，洗滌3次后，加入TMB底物溶液，室溫避光孵育5分鐘后終止反應(yīng)，于450nm測(cè)定OD值并計(jì)算IL-17含量。

1.2.4 PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的表達(dá)收集經(jīng)抗CD3和抗CD28單抗刺激培養(yǎng)24小時(shí)的PBMC，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入25μl Real-time PCR反應(yīng)體系中，檢測(cè) ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，人GAPDH作為管家基因。采用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)引物序列如下:人ROR-γt:上游引物:5'-CCGATGTGGACTTCGTTTTGA-3';下游引物:5'-CGGTGTGCTGCGGAAACT-3'。人 IFN-γ:上游引物:5'-GAATGTCCAACGCAAAGCAA-3';下游引物:5'-CGACCTCGAAACAGCATCTG-3'。人 IL-4:上游引物:5'-TGTGCTCCGGCAGTTCTACA-3';下游引物:5'-GTCGAGCCGTTTCAGGAATC-3'。擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 30秒，然后變性95℃ 5秒，退火延伸60℃30秒，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)判斷反應(yīng)質(zhì)量，用2-△△Ct法比較GD患者組和正常對(duì)照組間 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 表達(dá)水平的差異。

1.2.5 免疫組化染色檢測(cè)甲狀腺組織中IL-17+細(xì)胞的分布 將石蠟包埋的甲狀腺組織切片，脫蠟至水，0.1 mol/L 枸櫞酸(pH6.0)高溫修復(fù)抗原 5 分鐘，冷卻至室溫，10%山羊血清37℃封閉1小時(shí)后，棄血清，滴加10%山羊血清稀釋的抗人IL-17Ab(1∶100)，濕盒內(nèi)4℃冰箱過(guò)夜，洗滌3次，滴加二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育30分鐘，洗滌，DAB顯色5～10分鐘，自來(lái)水終止顯色，復(fù)染，封片，顯微鏡觀(guān)察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，對(duì)呈正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)，兩組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。不呈正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。兩組間采用雙變量相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺功能 收集的30例初發(fā)GD組患者血清中TSH濃度降低，甲狀腺激素FT3、FT4和自身抗體TgAb、TPOAb水平升高，符合GD的診斷標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

2.2 PBMC中Th17細(xì)胞的數(shù)量 與正常對(duì)照組(11.77 ±4.18)% 比較，初發(fā) GD 組(20.59 ±4.63)%外周血PBMC在經(jīng)抗CD3和抗CD28刺激培養(yǎng)24小時(shí)后，其中Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯升高(P ＜0.01，圖1)。

2.3 PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平 將來(lái)自?xún)山M的PBMC經(jīng)抗CD3和抗CD28刺激培養(yǎng)24小時(shí)后，應(yīng)用ELISA檢測(cè)其培養(yǎng)上清中IL-17的水平，初發(fā)GD組培養(yǎng)上清中 IL-17 的含量為(83.22 ±34.28)pg/ml，明顯高于正常對(duì)照組(19.74 ±5.99)pg/ml(P ＜0.01，圖2)。

表1 初發(fā)GD組和正常對(duì)照組甲狀腺功能Tab.1 Thyroid function of GD and health control groups

2.4 PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的表達(dá)初發(fā)GD組PBMC在經(jīng)抗CD3和抗CD28抗體刺激活化后，ROR-γt mRNA 的表達(dá)水平(1.67 ±0.98)與正常對(duì)照組(0.92±0.18)比較明顯增高(P＜0.05)。而 IFN-γ mRNA(0.31 ±0.07)、IL-4 mRNA(2.53 ±0.70)均較正常對(duì)照組(分別為 0.70 ±0.20和 7.11 ±1.41)明顯降低(P ＜0.01，表 2)。

2.5 初發(fā)GD組患者PBMC中Th17細(xì)胞百分率與ROR-γt、IFN-γ 和 IL-4 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性分析初發(fā)GD組患者，Th17細(xì)胞百分率與ROR-γt mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.5047，P=0.01);與 IFN-γ mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5085，P ＜0.01);與IL-4 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5372，P＜0.01)，見(jiàn)圖3。

圖1 外周血中CD4+IL-17+T(Th17)細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例Fig.1 Comparison of CD4+IL-17+T(Th17)proportion between two groups

圖2 初發(fā)GD組和正常對(duì)照組PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平Fig.2 The level of IL-17 in PBMC culture supernatant from health control and GD patients

表2 初發(fā)GD組和正常對(duì)照組 PBMC中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the ROR-γt，IFN-γ，IL-4 mRNA expression in GD and health control groups(±s)

表2 初發(fā)GD組和正常對(duì)照組 PBMC中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the ROR-γt，IFN-γ，IL-4 mRNA expression in GD and health control groups(±s)

Note:1)P ＜0.05;2)P ＜0.01 vs control.

IL-4 Control GD Groups ROR-γt IFN-γ 0.92 ±0.18 1.67 ±0.981)0.70 ±0.20 0.31 ±0.072)7.11 ±1.41 2.53 ±0.702)

圖3 初發(fā)GD患者CD4+IL17+T(Th17)細(xì)胞百分率與ROR-γt、IFN-γ和 IL-4 mRNA 表達(dá)相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between the CD4+IL17+T(Th17)cells proportion and the expression levels of ROR-γt，IFN-γ and IL-4 mRNA in PBMC from patients with GD

圖4 GD組和正常對(duì)照組甲狀腺組織HE染色及IL-17的表達(dá)(HE，×100;IL-17，×400)Fig.4 H＆E staining and the expression of IL-17 in thyroid gland from healthy controls and GD patients(HE，×100;IL-17，×400)

2.6 甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 手術(shù)切除的GD組甲狀腺組織中，濾泡上皮細(xì)胞增生，呈高柱狀或立方狀，濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)減少或消失，濾泡間可見(jiàn)不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。免疫組化結(jié)果:胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為IL-17+細(xì)胞。正常對(duì)照組未見(jiàn)IL-17+細(xì)胞。GD組甲狀腺組織濾泡間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在的IL-17+細(xì)胞(圖4)。

3 討論

傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為T(mén)h1細(xì)胞主要通過(guò)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞則主要通過(guò)分泌IL-4等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫。因?yàn)镚D主要由自身抗體引起，所以在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間里人們認(rèn)為GD是由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的。但隨著對(duì)GD患者和小鼠GD模型的深入研究，這一概念遇到了挑戰(zhàn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，許多病人體內(nèi)的TSAbs屬于IgG1(其產(chǎn)生與Th1亞群相關(guān))［2］。在所有小鼠 GD模型中，Th1和Th2均能引起抗TSHR抗體的產(chǎn)生，而且產(chǎn)生的TSAbs大部分屬于與Th1亞群相關(guān)的IgG1。小鼠脾細(xì)胞在TSHR抗原的刺激下可分泌Th1類(lèi)細(xì)胞因子如IFN-γ。在用不同方法誘導(dǎo)的小鼠GD模型中，Th1和Th2所起的作用不同，如用表達(dá)TSHR和MHCⅡ類(lèi)分子的纖維母細(xì)胞或B細(xì)胞誘導(dǎo)的模型中，Th2細(xì)胞起著重要作用;而在用質(zhì)粒、腺病毒、或表達(dá)TSHR的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的模型中，Th1細(xì)胞則起著關(guān)鍵作用［3］。上述這些有爭(zhēng)議的結(jié)果說(shuō)明GD的發(fā)生可能與除Th1和Th2細(xì)胞以外的免疫反應(yīng)有關(guān)。

Th17是新近發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)生IL-17的另一CD4+T細(xì)胞亞群［4，5］。盡管在很長(zhǎng)一段時(shí)間里 Th1和Th2細(xì)胞在許多自身免疫病發(fā)生中的作用存在爭(zhēng)議，但近年來(lái)許多的研究證實(shí)，Th17在許多自身免疫病如多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(EAE)、碘誘導(dǎo)的非肥胖糖尿病小鼠自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力和銀屑病等(這些自身免疫病在以前均被認(rèn)為是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的)的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用［6，7］。Figueroa-Vega等［8］的研究證實(shí)，西班牙橋本氏甲狀腺炎病人體內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增加。Horie［9］與其同事最近的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17+/+和IL-17-/-BALB/c小鼠發(fā)生Graves’病甲狀腺功能亢進(jìn)的幾率是相同的，而在 NODH2 小鼠，只有 IL-17 小鼠出現(xiàn)Graves’病甲狀腺功能亢進(jìn)，而IL-17-/-NODH2h4小鼠不發(fā)生Graves’病甲狀腺功能亢進(jìn)，表明Th17在Graves’病甲狀腺功能亢進(jìn)發(fā)生中的作用尚與遺傳背景有關(guān)［9］。為此本研究探討了 Th17在中國(guó)人GD發(fā)生中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，GD病人外周血單個(gè)核細(xì)胞在抗CD3和抗CD28刺激活化后ROR-γt的表達(dá)、分化形成的Th17細(xì)胞以及培養(yǎng)上清中IL-17的水平均較正常人明顯增加。ROR-γt作為T(mén)h17細(xì)胞的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Th17細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能起決定性作用［10］。Th17細(xì)胞主要通過(guò)產(chǎn)生 IL-17(IL-17A)發(fā)揮生物學(xué)作用，IL-17可增強(qiáng)趨化性細(xì)胞因子、IL-1、IL-6、TNF-γ、細(xì)胞黏附分子和其他炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞向炎癥部位遷移［11］。因此，GD病人外周血中產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞的增加將有助于淋巴細(xì)胞向甲狀腺組織浸潤(rùn)。

淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是自身免疫性甲狀腺疾病的重要特征，我們對(duì)GD病人甲狀腺組織的形態(tài)學(xué)觀(guān)察也證實(shí)，GD病人甲狀腺組織中有散在的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化結(jié)果顯示，在浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)散在的IL-17+細(xì)胞(Th17)。

Th1細(xì)胞主要通過(guò)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞則主要通過(guò)分泌IL-4等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫。IFN-γ能夠促進(jìn)自身的表達(dá)以及Th1細(xì)胞的分化，并抑制Th17細(xì)胞的分化。類(lèi)似的，IL-4能夠促進(jìn)自身表達(dá)以及Th2細(xì)胞的分化，且抑制Th17細(xì)胞的分化。但I(xiàn)L-17卻不能直接促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，也不能抑制Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞的分化發(fā)育。由于 IFN-γ、IL-4抑制 Th17細(xì)胞的分化，Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞可以在一定程度上調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的發(fā)育［12］。本研究通過(guò)應(yīng)用qRT-PCR方法，檢測(cè) PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ 及 IL-4 mRNA 的表達(dá)量，進(jìn)一步探討CD4+T細(xì)胞亞群在Graves'病發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)初發(fā)Graves'病患者組ROR-γt mRNA的表達(dá)量顯著增高，而IFN-γmRNA與IL-4 mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常對(duì)照組。相關(guān)性分析顯示，初發(fā)GD患者組Th17細(xì)胞百分率與PBMC中ROR-γt mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，與PBMC中IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)。這表明PBMC中的CD4+T在接受刺激活化后核轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達(dá)增多誘導(dǎo)其向Th17細(xì)胞分化發(fā)育，同時(shí)也證明IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子抑制Th17細(xì)胞的分化，或者說(shuō)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞拮抗Th17細(xì)胞的分化。由于機(jī)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞各亞群的發(fā)育、分化及調(diào)節(jié)之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，與之相關(guān)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系亦尚未完全明確。我們以前的研究曾發(fā)現(xiàn)，GD病人PBMC中與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育及功能相關(guān)的Foxp3和TGF-γmRNA表達(dá)明顯降低［13］，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能缺陷在GD的發(fā)生中可能也起一定的作用，因此，有關(guān)GD發(fā)生的詳細(xì)免疫學(xué)作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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