朱傲雪 楊 穎 張嘉敏 楊啟修 高歡歡 朱自嚴(yán)

(上海市血液中心輸血研究所血型參比實(shí)驗(yàn)室，上海200051)

人類中性粒細(xì)胞抗原(Human neutrophil antigens，HNA)是位于中性粒細(xì)胞膜上的多肽結(jié)構(gòu)。目前已知有五類 HNA系統(tǒng)，分別是 HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和 HNA-5，其抗原分別位于 CD16、CD177、膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)子樣蛋白2、CD11b 和CD11a 上［1，2］。

HNA同種抗體與多種臨床疾病相關(guān)，例如同種免疫新生兒中性粒細(xì)胞減少癥，自身免疫中性粒細(xì)胞減少癥和輸血相關(guān)性急性肺損傷(Transfusion-related acute lung injury，TRALI) 等［1］。其中 TRALI是在輸血過(guò)程中或輸血后6小時(shí)內(nèi)發(fā)生的一種急性呼吸窘迫綜合征，嚴(yán)重者可引起死亡。大部分的TRALI，是由于輸注的血液制品中含有白細(xì)胞抗體(-HLA 和-HNA) 引 起 的［3］。HNA-1a、HNA-1b、HNA-2a、HNA-3a相應(yīng)抗體都有可能引起TRALI，其中抗HNA-3a抗體最常見(jiàn)，尤其在致命性TRALI病例中［4］。因此了解HNA的分布及其分子特征，對(duì)于評(píng)估HNA同種抗體引起疾病的風(fēng)險(xiǎn)很重要。

本研究采用文獻(xiàn)已報(bào)道的引物，建立序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)作為主要檢測(cè)方法，對(duì)上海地區(qū)326份隨機(jī)健康獻(xiàn)血者樣本的HNA-1、3-5各系統(tǒng)進(jìn)行基因型分析，利用測(cè)序或PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)等方法進(jìn)行分子特征分析;而HNA-2a抗原表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄剪切影響，無(wú)法采用以DNA為基礎(chǔ)的分析方法，因此我們另外隨機(jī)采集了同一地區(qū)91名健康獻(xiàn)血者的新鮮外周血，用流式細(xì)胞儀分析HNA-2a抗原表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 326份血樣和91份新鮮血樣均來(lái)自上海市血液中心職工或隨機(jī)健康獻(xiàn)血者，所有血樣均為EDTA抗凝的外周血，并獲取知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒(北京天根公司);金牌酶(Applied Biosystems);限制性內(nèi)切酶Bsp1286I(NEB);鼠源抗CD177單抗和FITC標(biāo)記的鼠源抗CD16單抗均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Jackson Immuno Research);Gene Amp PCR System9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI新加坡公司);KUBOT3300臺(tái)式離心機(jī)(日本久保田公司);Tanon EPS 100穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(上海天能科技有限公司);Imagemaster VDS凝膠成像儀(美國(guó)法瑪西亞公司);FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司);引物合成、測(cè)序及克隆測(cè)序均委托上海生工公司完成。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA抽提 使用天根全血DNA抽提試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)326份隨機(jī)健康獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行基因組DNA的抽提。紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA濃度及質(zhì)量，A260/A280均在1.8左右，A260/A230均大于2，經(jīng)計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)提取的基因組DNA濃度均在60 ng/μl左右，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 中國(guó)上海人群HNA-1、3-5各系統(tǒng)分析

1.3.2.1 PCR-SSP方法檢測(cè)樣本基因型 根據(jù)參考文獻(xiàn)［5-9］合成引物，具體序列及對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物片段預(yù)期大小見(jiàn)表1。在上述文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件均進(jìn)行了調(diào)整。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為10 μl∶1 μl 10×PCR buffer，1μl 2 mmol/L dNTP，金牌酶 1 U，0.8 μl 25 mmol/L MgCl2，10 μmol/L上下游引物各 0.5 μl，10 μmol/L內(nèi)參引物HGF、HGR 各 0.5 μl，DNA 模板 1 μl(約 60 ng)。HNA-1系統(tǒng)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃變性8分鐘，反應(yīng)擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94℃變性30秒，57℃復(fù)性50秒，72℃延伸30秒)，72℃保溫5分鐘。HNA-3-5系統(tǒng)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃變性8分鐘，反應(yīng)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)(94℃變性30秒，64℃復(fù)性40秒，72℃延伸30秒)，反應(yīng)擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)(94℃變性30秒，61℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒)，72℃保溫5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中120 V電泳30分鐘，凝膠成像儀觀察結(jié)果。用以上方法對(duì)326份樣品進(jìn)行HNA-1、3-5各系統(tǒng)的基因分型。

1.3.2.2 測(cè)序分析 HNA-1、HNA-3 和 HNA-4 系統(tǒng)挑選PCR-SSP結(jié)果分別為HNA-1a純合、HNA-1b純合、HNA-3a純合、HNA-3b純合、HNA-4a陽(yáng)性純合的樣本各6份，進(jìn)行測(cè)序分析和克隆測(cè)序。重新招募以上實(shí)驗(yàn)樣本中具有HNA-1a純合和HNA-1b純合的本單位職工或獻(xiàn)血員，在獲取知情同意后采集新鮮外周血樣，采用參考文獻(xiàn)［10］的方法抽提RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，并與上述測(cè)序、克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析。測(cè)序相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.3.2.3 PCR-RFLP方法分析 HNA-5系統(tǒng) 挑選PCR-SSP結(jié)果為HNA-5a陽(yáng)性純合、HNA-5a陰性純合和HNA-5a雜合的樣本各2份，根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3.3 中國(guó)上海人群HNA-2系統(tǒng)的分析 根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］的方法，制備中性粒細(xì)胞，使用鼠源抗CD177單抗作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)抗體(1∶60稀釋)作為二抗，同時(shí)FITC標(biāo)記的鼠源抗CD16單抗作為粒細(xì)胞標(biāo)記平行對(duì)照，用流式細(xì)胞儀分析91份隨機(jī)健康新鮮樣本HNA-2a抗原表達(dá)情況，并使用CellQuest Pro軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用率的計(jì)算公式［13］和基因計(jì)數(shù)法［14］分別計(jì)算HNA-1、3-5各系統(tǒng)的基因型頻率、基因頻率和流式細(xì)胞術(shù)分析得到的HNA-2a抗原頻率。應(yīng)用 Haploview4.2軟件(可從 http://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/programs/medical-and-population-genetics/haploview/downloads下載)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［7，9，15-18］對(duì)比3個(gè)不同地區(qū)人群的5類 HNA系統(tǒng)分布情況，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0，使用 χ2檢驗(yàn)及 Fisher's精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果 電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。其中圖1A、1B和1C分別為HNA-1a引物、HNA-1b引物和HNA-1c引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，可判斷出泳道1、2為 HNA-1a純合子，泳道3、4為 HNA-1a/1b雜合子，泳道5、6為HNA-1b純合子。圖1D和1E分別為HNA-3a引物、HNA-3b引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，可判斷出泳道7、8、9為HNA-3a純合子，泳道10、11為HNA-3a/3b雜合子，泳道12為HNA-3b純合子。圖1F和1G分別為HNA-4a陽(yáng)性引物、HNA-4a陰性引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，可判斷出泳道 13、14、15、16、17、18 均為 HNA-4a 陽(yáng)性純合子，未發(fā)現(xiàn)HNA-4a陰性等位基因。圖1H和1I分別為HNA-5a陽(yáng)性引物和HNA-5a陰性引物對(duì)應(yīng)PCR 擴(kuò)增結(jié)果，可判斷出泳道19、20、21、22為HNA-5a陽(yáng)性純合子，泳道23為HNA-5a雜合子，泳道24為HNA-5a陰性純合子。

2.2 測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果與PCR-SSP結(jié)果均為一致，HNA-1，3-4各系統(tǒng)結(jié)果見(jiàn)圖2。HNA-1a純合、HNA-1b純合樣本的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)雜合峰，干擾了結(jié)果判定，加用cDNA測(cè)序和克隆測(cè)序后，得到明確結(jié)果，且符合PCR-SSP結(jié)果。

圖2A是PCR-SSP結(jié)果為HNA-1a純合樣本的克隆測(cè)序結(jié)果，圖2B是PCR-SSP結(jié)果為HNA-1b純合樣本的克隆測(cè)序結(jié)果?？捎^察到FCGR3B*01等位基因 (編碼 HNA-1a)與 FCGR3B*02(編碼HNA-1b)等位基因在編碼區(qū)域的5個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為141位G/C，147位C/T，227位A/G，277位G/A，349 位 G/A，與 GenBank 序列 J0412、X16863一致。

圖2C和2D為HNA-1a/1b變異體的克隆測(cè)序結(jié)果，其中一個(gè)等位基因?yàn)檎CGR3B*02等位基因，另一個(gè)等位基因?yàn)樽儺惖腇CGR3B*01等位基因(141G，147C，227G，277G，349A)。本研究發(fā)現(xiàn)2例這種類型的變異體。

圖1 PCR-SSP分析結(jié)果Fig.1 PCR-SSP amplification results

圖2 測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results

圖2 E為HNA-1b/1b變異體的cDNA測(cè)序結(jié)果，該樣本為 HNA-1b 純合子，在141、147、227、349位點(diǎn)上與報(bào)道的FCGR3B*02等位基因相同，但在277位點(diǎn)上為G/A，兼具HNA-1a/1b特征，說(shuō)明該HNA-1b純合子所攜帶的2個(gè)等位基因中的1個(gè)為變異的FCGR3B*02等位基因。本研究發(fā)現(xiàn)1例這種類型變異體。

圖3 PCR-RFLP結(jié)果Fig.3 Amplification results of PCR-RFLP

圖2F為PCR-SSP結(jié)果為HNA-3a純合樣本的測(cè)序結(jié)果，圖2G為PCR-SSP結(jié)果為HNA-3b純合樣本的測(cè)序結(jié)果。可觀察到HNA-3a/3b的多態(tài)性在于膽堿運(yùn)輸子樣蛋白2基因461位G＞A的突變。

圖2H為PCR-SSP結(jié)果為HNA-4a陽(yáng)性純合樣本的測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果表明ITGAM基因230位是G，與 GenBank序列 NM_000632一致。由于缺乏HNA-4a陰性樣本，本研究無(wú)法對(duì)ITGAM*230A等位基因進(jìn)行測(cè)序分析。

2.3 PCR-RFLP結(jié)果 PCR-RFLP結(jié)果見(jiàn)圖3。泳道1為HNA-5a陽(yáng)性純合子(136 bp和65 bp)，泳道2為HNA-5a雜合子(201、136和65 bp)，泳道3為HNA-5a陰性純合子(201 bp)。該結(jié)果與PCR-SSP的結(jié)果也吻合。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HNA-2a抗原表達(dá)Fig.4 Flow Cytometry detecting the HNA-2a antigen expression on neutrophils

表2 中國(guó)上海地區(qū)漢族人群HNA分布情況以及與其他國(guó)家或地區(qū)人群的比較Tab.2 HNA distribution of Shanghai Han population and compared with populations in other countries or regions

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 流式結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4 A為所選細(xì)胞，4B為與抗CD16單抗反應(yīng)的細(xì)胞，用于確定所選的細(xì)胞群為中性粒細(xì)胞，4C和4D為與抗CD177單抗反應(yīng)(用于指示HNA-2a抗原表達(dá)與否)的細(xì)胞，前者具有雙峰，雙峰分別對(duì)應(yīng)指示CD177-、CD177+粒細(xì)胞，具有雙峰格局的在人群中的比例為94.5%(86/91)，其中CD177+粒細(xì)胞占30% ～70%為最多見(jiàn);而4D為單峰，大部分粒細(xì)胞(＞90%)呈現(xiàn)CD177+，這組占人群比例約5.5%(5/91)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］關(guān)于判定HNA-2a陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn):與抗CD177抗體反應(yīng)的中性粒細(xì)胞占總中性粒細(xì)胞5%以上者，視為HNA-2a陽(yáng)性樣本，本研究確認(rèn)91份樣本均為HNA-2a陽(yáng)性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)Haploview軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果表明HNA-1-5各基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。中國(guó)上海人群與中國(guó)廣州人群相比，在HNA-3系統(tǒng)存在顯著差異(0.01＜P＜0.05)。中國(guó)上海人群與高加索人群在HNA1-5各系統(tǒng)上均存在非常顯著的差異(P＜0.01)。

3 討論

在不同國(guó)家和地區(qū)，HNA的分布情況會(huì)顯示出一定的差異。與廣州人群［15］和高加索人群［7，9，16-18］相比，本研究發(fā)現(xiàn)上海人群HNA-3b基因頻率要高。對(duì)于HNA-3b純合子的人群，如果有輸血史或妊娠史，可能會(huì)產(chǎn)生抗HNA-3a抗體，若將這些含有抗HNA-3a抗體的血液輸注給HNA-3a純合子的人群，可能會(huì)產(chǎn)生TRALI［4］。上海地區(qū)人群是不是具有更高TRALI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，需要引起關(guān)注，可針對(duì)性在輸血前進(jìn)行供體血液HNA同種抗體檢測(cè)，以排除潛在高危血液的輸注風(fēng)險(xiǎn)。這也是本研究的意義所在。

HNA-1抗原由位于1q23-24的FCGR3B編碼控制。其同種抗體據(jù)報(bào)道與同種免疫新生兒中性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫中性粒細(xì)胞減少癥、TRALI有關(guān)［1］。FCGR3B 與 FCGR3A(編碼 FcγRIIIa)高度同源。FCGR3A在141、147和277位與FCGR3B*01相同，在227和349位與FCGR3B*02相同。因?yàn)镕CGR3B與FCGR3A的高度同源性，本研究原先使用的HNA-1 PCR-SSP引物(借鑒參考文獻(xiàn)［19］)在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了假陽(yáng)性;而我們重新合成的新引物［5］則可克服此缺點(diǎn)。而且HNA-1采用普通PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果也能受FCGR3A基因的干擾，在相應(yīng)的位點(diǎn)出現(xiàn)雜合現(xiàn)象，而克隆測(cè)序和cDNA為模板的測(cè)序方法可有效去除FCGR3A序列的影響。

FCGR3B*01等位基因 (編碼 HNA-1a)與FCGR3B*02(編碼HNA-1b)等位基因在編碼區(qū)域有5個(gè)堿基不同，1a和1b分別對(duì)應(yīng)141位G/C，147位 C/T，227 位 A/G，277 位 G/A，349 位 G/A［20-23］。目前已有數(shù)種FCGR3B序列變異體被描述［24］，這些嵌合的等位基因大部分帶有單堿基替換，大部分為上述5個(gè)SNP位點(diǎn)中的一個(gè)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3例FCGR3B的變異體，其中2例為HNA-1a/1b樣本FCGR3B*01等位基因發(fā)生227 A→G和349 G→A的突變，另1例為HNA-1b/1b樣本一條染色體在FCGR3B*02等位基因發(fā)生了277 A→G的突變，而另一條染色體上的FCGR3B*02序列是正常的，導(dǎo)致該樣本在FCGR3B*02序列277位呈現(xiàn)雜合(G/A)狀態(tài)，這3例變異體的攜帶者身體健康。

HNA-2a是一種高頻抗原。HNA-2系統(tǒng)同種抗體與同種免疫新生兒中性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫中性粒細(xì)胞減少癥、TRALI、藥物誘發(fā)中性粒細(xì)胞減少癥、骨髓移植后移植物被排斥有關(guān)［1］。因?yàn)檫@個(gè)系統(tǒng)多態(tài)性的機(jī)制發(fā)生于轉(zhuǎn)錄剪切中，檢材要求較高，需要新鮮的細(xì)胞，陳舊血液和DNA樣品不能作為分析模板。目前在HNA-2a系統(tǒng)中已檢測(cè)出NB1和PRV-1兩個(gè)等位基因，它們cDNA序列之間有4個(gè)堿基不同，其中最常見(jiàn)的外顯子1第42位G＞C的SNP位點(diǎn)也許和HNA-2抗原的表達(dá)水平有關(guān)［12］，本研究也證實(shí)了上海地區(qū)人群呈現(xiàn)出2種格局HNA-2抗原的表達(dá)水平，這種差異表達(dá)是否也和這些SNP位點(diǎn)相關(guān)及差異表達(dá)的意義，擬在后續(xù)研究中詳細(xì)探討。

HNA-4a是一種高頻抗原，在不同的種族中的頻率都很高。但由于研究樣本量的限制，本文中326個(gè)樣本均為HNA-4a陽(yáng)性，未發(fā)現(xiàn)HNA-4a陰性樣本。HNA-5a也是一種高頻抗原，現(xiàn)在關(guān)于HNA-5系統(tǒng)在臨床上的功能還尚未清楚。所以無(wú)法預(yù)測(cè)HNA-5系統(tǒng)在不同人群中的分布差異引起的臨床意義。

中國(guó)是一個(gè)多民族多人口的國(guó)家，有自己獨(dú)特的HNA分布情況。通過(guò)這次對(duì)中國(guó)人群HNA系統(tǒng)分布調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)絕大部分的結(jié)果與其他國(guó)家的數(shù)據(jù)資料有區(qū)別，甚至在不同地區(qū)也有差異。因此，需要填補(bǔ)我國(guó)在此方面的數(shù)據(jù)空白，提高臨床輸血的安全性，因此進(jìn)一步地研究HNA及其相關(guān)領(lǐng)域?qū)τ谖覈?guó)今后的臨床輸血安全具有重要的意義。

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